1、ICS 67.040 C 53 毒国中华人民共和国国家标准GB/T 5009.23-2006 代替GB/T5009.23 2003 食品中黄曲霉毒素B，、B2、G，、G2的测定Determination of aflatoxins B, ,B2 ,G, ,G2 in foods EEE-sEE- EE-E | EE-EE l -EE-E EE-EE -EE-EE -EEE-E E-aa-EE-aa -EE-EE -EEE-EE -鑫. | 圄 BEBEE-aEE -EEE- 070402000377 2006-09-14发布2007-01-01实施中华人民共和国卫生部也士中国国家标准化管理委员
2、会战WGB/T 5009.23-2006 前吉本标准代替GB/T5009. 23一2003(食品中黄曲霉毒素且、鸟、G1、马的测定本标准与GB/T5009.23-2003相比主要变化如下:十一增加了第三法，即高效液梧色谱测定方法。第三法对应于国际分析家协会CAOAC)AOAC Official Method 994. 08方法用多功能柱检测玉米、杏仁、巴西坚果、花生和阿月浑子果中黄曲霉毒素的方法Aflatoxins in Corn, Almonds , Brazil Nuts , Peanuts, and Pistachio Nuts Multifunctional Column CMycos
3、ep) M曰hodJ。本标准与AOACOfficial Method 994.08的一致性程度为非等效。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准第一法由中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所、中华人民共和国青岛进出口商品检验局负责起草。本标准第二法由北京市卫生防疫站、中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所、卫生部食品卫生监督栓验所负责起草。本标准第三法由中国疾病预防控制中心营养与食品安全所负责起草;山东省疾病预防控制中心、宁波市疾病预防控制中心、厦门市疾病预防控制中心参加起草。本标准第三法主要起草人:刘秀梅、王君、李凤琴、计融、陈金东、姚再平、骆和东、张宏元。本标准于1985年首次发布，
4、1996年第一次修订，2003年第二次修订，本次为第三次修订。I GB/T 5009.23-2006 食品中黄曲霉毒素B，、B2、G，、G2的测定1 范围本标准规定了各种食品中黄曲霉毒素乱、马、G1、马的测定方法。本标准的第一法、第二法适用于各种食品中黄曲霉毒素B1、岛、G1、G2的测定，第三法适用于大米、玉米、花生、杏仁、核桃、松子等食品中黄曲霉毒鑫品捆品梅岛、马的损tl定。本标准第一法和第二法的最低检弗雷i黄曲霉毒素B1、G乃问004g，Bz、G2为O.002附最低检出被度:黄曲霉毒素在、G1为第三法中黄曲霉毒素的B1、G1为O.20g/kg， 100.0g/L，Bz、Gz为度川浓凡的问中
5、OT4nHF气UE口样。于为挡G4b1、LI JrJ ub总文件，其随后所有胁议的各方研究是否可使用这些GB/T 5009. 3 原理试样经提取、4 试知j4. 1罔GB/T5009.2 4.2 次氯酸锅洛蔽(消44.3 苯-乙醇也水(46+35十将上下层溶液分别置于具塞瓶上加热，待清晰后，即停止加热，取上槽内。将薄层板放入展开槽内，预先饱和10min;口4.4 疏酸(1十3)。4.5 黄曲霉毒素B1、Bz、G1、G2标准溶液如下:4.5.1 单一标准榕液(10g/mL):准确称取黄曲霉毒素B1、G1标准品各1mg1. 2 mg，黄曲霉毒素B2、G2标准品各0.5mg0.6mg，用苯乙腊混合液
6、作洛剂。配制方法、被度及纯度的测定参照GB/T 5009. 22-2003中3.140黄曲霉毒素B1、Bz、G1、马的分子质量及用苯-乙睛作溶剂时的最大吸收峰的波长及摩尔消光系数中，振摇5min，静置过夜。榕液出现混浊，则在800C水浴见表1。GB/T 5009.23-2006 表1黄曲毒毒素的分子质量、最大眼收峰波长及摩尔消光系数黄曲霉毒素名称最大吸收峰波长/nm摩尔消光系数分子质量B1 346 19800 312 B, 348 20900 314 Gj 353 17 100 328 G, 354 18200 330 4.5.2 各标准使用液:以下各标准液均用苯乙睛提合液配制。4.5.2.1
7、 黄曲霉毒素渥合标准使用液1:每毫升相当于0.2月黄曲霉毒素Bl、G1及o.1吨黄曲霉毒素岛、Gz，作定位用。4.5.2.2 黄曲霉毒素混合标准使用液II:每毫升相当于0.04g黄曲霉毒素Bl、G1及o.02吨黄曲霉毒素Bz、Gz，作最低检出量用。5 仪器罔GB/T5009.22-2003中4.14.9。6 分析步骤6. 1 取样向GB/T5009.22-2003中5.1。6.2 提取同GB/T5009.222003中5.2。6.3 测定6.3. 1 单向展开法6. 3. 1. 1 薄层板的制备同GB/T5009.22-2003中5.3. 1. 1。6.3. 1. 2 点样罔GB/T5009.
8、22-2003中5.3.1. 2。滴加式样如下:第一点:10 L黄曲霉毒素提合标准使用液E。第二点:20L样液。第二点:20L样液十10L黄曲霉毒素混合标准使用液E。第四点:20L样液+10L黄曲霉毒素混合标准使用液I。6.3. 1. 3 展开与观察黄曲霉毒素Bl、岛、G1、Gz的比移值依次排列为BlBzG1GZ。在展开槽内加10mL无水乙酶，预展12cm，取出挥干，再于另一展开槽内加10mL丙翻-三氯甲:境(8十92)，展开10cm12 cm，取出。在紫外光灯下观察结果，方法如下。6. 3. 1. 3. 1 由于样液点上加滴黄曲霉毒素混合标准使用液I或II，可使黄曲霉毒素Bl、民、G1、Gz
9、分别与样液中的黄曲霉毒素Bl、民、G1、Gz荧光点重叠。如样液为阴性，薄层板上的第三点中黄曲霉毒素盐、Bz、G1、Gz依次为0.0004阅、0.0002阅、0.0004阅、0.0002吨，可用作检查在样液内黄曲霉毒素Bl、马、G1、Gz的最低检出量是否正常出现。如为阳性，则起定位作用。薄层板上的第四点中黄曲霉毒素Bl、Bz、G1、Gz依次为0.002阅、0.001月、0.002阅、0.001吨，主要起定位作用。6.3. 1. 3. 2 若第二点在与黄曲霉毒素Bl、Bz的相应位置上无蓝紫色荧光点;或在与黄曲霉毒素G1、Gz的相应位置上无黄绿色荧光点，表示试样中黄曲霉毒素Bl、G1含量在5g/kg
10、以下;Bz、Gz含量在2.5g/kg以下;如在相应位置上有以上荧光点，则需进行确证试验。GB/T 5009.23-2006 6.3. 1.4 确证试验6. 3. 1. 4. 1 黄曲霉毒素与三氟乙酸反应产生衍生物，只限于Bj和Gj;B2和G2与三氟乙酸不起反应。民和Gj的衍生物比移值为BjGj。于薄层板左边依次滴加两个点。第一点:10L黄曲霉毒素渥合标准使用液E。第二点:20L样液。于以上两点各加三氟乙酸l小滴盖于其上，反应5min后，用吹风机吹热风2min，使热风吹到薄层板上的温度不高于400C。再于薄层板上滴加以下两个点。第三点:10L黄曲霉毒素混合标准使用液E。第四点:20L样液。再展开
11、(同6.3.1.3)，在紫外光灯下观察样被是否产生与黄曲霉毒素Bj或Gj标准点相同的衍生物，未加三氟乙酸的三、四两点，可依次作为样液与标准的街生物空白对照。6.3. 1.4.2 黄曲霉毒素B2和G2的确证试验，可用苯-乙醇水(46十35十19)展开，若标准点与样液点出现重叠，即可确定。6.3. 1. 4. 3 在展开的薄层板上喷以硫酸。十3)，黄曲霉毒素昆、B2、Gj、G2都变为黄色荧光。6.3. 1. 5 稀释定量样液中黄曲霉毒素Bj、B2、Gj、G2荧光点的荧光强度如各与黄霉毒素Bj、民、Gj、G2标准点的最低检出最(Bj、Gj为0.0004吨，B2、G2为0.0002g)的荧光强度一致，
12、则试样中黄曲霉毒素Bj、Gj含量为5g/kg;Bz、G2含量为2.5g/kg。如样液中任何一种黄曲霉毒素的荧光强度比其最低检出量强，则需逐一进行定量，直至样液点的荧光强度与最低检出量点的荧光强度一致为止。定量与计算方法参照GB/T5009.22-2003中5.3.1. 5与5.3. 1. 6。6.3.2 xl向展开法6.3.2.1 滴加两点法6.3.2. 1. 1 点样:取薄层板三块，在距下端3cm基线上滴加黄曲霉毒素标准使用液与样液。即在三块板的距左边缘o.8 cml cm处各滴加10L黄曲霉毒素混合标准使用液II，在距左边缘2.8 cm 3.0 cm处各漓加20L样液，然后在第二板的样液点
13、上加滴10L黄曲霉毒素混合标准使用液II;在第三板上的样液点上加滴10L黄曲霉毒素混合标准使用液I。6.3.2. 1. 2 展开:同GB/T5009.22-2003中5.3.2.1. 2。6.3.2. 1.3 观察及评定结果如下:6. 3. 2. 1. 3. 1 在紫外光灯下观察第一、二板，若第二板的第二点在黄曲霉毒素Bj、民、Gj、马标准点的相应处出现最低检出量，而第一板在与第二板的梧同位置上未出现荧光点，则试样中黄曲霉毒素Bj、G1含量在5g/kg以下;鸟、G2的含量在2.5g/kg以下。6. 3. 2. 1. 3. 2 若第一板在与第二板的相同位置上各出现荧光点，则将第一板与第三板比较，
14、看第三板上第二点与第一板上第二点的相同位置的荧光点是否各与其黄曲霉毒素Bj、岛、Gj、G2标准点重叠，如果重叠，再接6.3. 2. 1. 3. 3进行所需的确证试验。6. 3. 2. 1. 3. 3 黄曲霉毒素旦、Gj的确证试验:取薄层板两块，于第四、第五两板距左边缘O.8 cm 1 cm处各滴加10L黄曲霉毒素渥合标准使用液E及1漓三氟乙酸，距左边缘2.8 cm3 cm处，第四板滴加20L样液及1滴三氟乙酸;第五板滴加20L样液、10L黄曲霉毒素氓合标准使用液E及1滴三氟乙酸。产生衍生物的步骤及展开方法向GB/T5009. 22-2003中5.3.2.1，观察样液点是否各产生与其黄曲霉毒素B
15、1或Gj标准点重叠的衍生物。观察时，可将第一板作为样液的衍生物空白板。如样液黄曲霉毒素Bl、B2、G1、G2含量高时，则将样液稀释后按6.3.1.4作确证试验。稀释定量与结果计算参照GB/T5009.22-2003中5.3. 2. 1. 5与5.3. 2. 1. 6。6.3.2.2 j面加一点法同GB/5009.22一2003中5.3.2.2。所不同的地方是在薄层上滴加标准液时以黄曲霉毒素棍合标准使用液E代替黄曲霉毒素Bl标准使用液(0.04g/mL)。稀释定量与结果计算参照GB/T 5009. 22-2003中5.3.2.2与5.3. 1. 6。GB/T 5009.23-2006 第二法微桂
16、筛选法7 原理试样提取液通过由氧化铝与硅娱吸附剂组成的微柱层析管，杂质被氧化铝吸附，黄曲霉毒素被硅镜股附剂吸附，在365nm紫外线下呈蓝紫色荧光，其荧光强度在一定范围内与黄曲霉毒素的含量成正比，由于微柱不能分离盐、Bz、G1、马，故结果为嘉温陆薛毒蠢的总量。8 试剂10 分析步骤g/r是L的使用液，避8. 1 石油醒:沸程600C90。8.2 中性氧化铝:层析用8. 3 8.4 8.5 8.6 8. 7 8.8 脱脂棉:用8.9 黄曲霉毒素光冷藏。9 仪器9. 1 紫外光灯:89.2 微柱管:内径9.3 微柱管架。9.4 微量注射器:5010. 1 提取飞10. 1. 1 粮食、花生及其制品:
17、取液，30mL石油髓，密塞振摇30min , 意切勿将石油酿层带入滤液中)，转入分液漏形瓶中，如100mL甲醇水溶筒中，收集50mL甲醇水滤液(注inL硫酸铀溶液(20g/L)稀释，加三氯甲烧10 mL，轻摇2min3 min，静置分层，三氯甲烧层通过装有5g无水硫酸铀的小漏斗脱水(以少量脱脂棉球塞住漏斗颈口，并以少量三氯甲:境润湿)，并滤入10mL比色管中，再向分液漏斗中加3mL王氯甲烧重提一次，脱水后滤人原比色管中，以少量三氯甲:境洗漏斗并定容至10.0mL，密塞，提匀，待测。此样被1mL相当1.0g试样。10. 1.2 植物油:称:昆匀油样10.00g于20mL的烧杯中，用50mL石油醒
18、分数次洗入分被漏斗中，加50 mL甲醇水轻摇2min3 min，静置分层，将下层甲醇水转入另一分液漏斗中，加50mL硫酸铀水洛液(20g/L)稀释，加三氯甲皖10mL，以下按10.1.1自轻摇2min3 min起操作。此样液1mL 八二jlbsJr京五结在袭警扩，连授足这铲弘髦笼络客运滋核挺绕经忍您读岔露系俨然忽密银钱德续努GB/T 5009.23-2006 相当1.0g试样。10. 1.3 发酵酒、酱油、醋等水榕性试样:啤酒等含二氧化碳的试样，需在烧杯中于水浴上加热、搅拌、除去气温，否则易乳化。称混匀试样20.00g于小烧杯中，以80mL硫酸纳溶液(20g/L)洗入分液漏斗中，加三氯甲:境1
19、0mL，此样液1mL相当2.0g试样。10. 1.4 腐乳、黄酱类:称取1昆匀试样20.00g于具塞锥形瓶中，加甲醇水100mL，石油醒20mL。振荡30min，静置片刻，以折叠快速定性滤纸过滤于50mL具塞量筒中，收集甲醇水滤攘50mL(相当于10 g试样，因为10g试样中约含有5mL水)，置于分液漏斗中，加入三氯甲:皖10mL，以下按10.1. 1自轻摇2min3 min-.起操作。此样液l皿L相当1.0g试样。10.2 测定10.2. 1 微柱管的制备:以少量硫酸铀(80日100自),0.5 铝，1.5 cm酸性氧化铝，3每装一种试剂要适当敲!素Bl标准ong、5展开时，柱管均10.2.
20、3 结果黄曲霉毒素Bl试样管中硅镜新提取试样。7干，以少量苯证，并测定黄曲11 原理质、色素及嵌水化合色谱系统分析，外标法12 试剂和材料12. 1 黄曲霉毒素Bl、民、G1、G212.2 乙脯，色谱纯、分析纯。12.3 三氟乙酸，分析纯。12.4 正己烧，分析纯。12.5 水，电导率(250C)0.01mS/m。d孀摇撼圆圆踏踏地噬际队100吕)，1.5cm中性氧化堵塞，装试剂时管要垂直，以免若是空气中吸水活性下降。，另取三支微柱管，各L，相当于黄曲霉毒)展开剂，在加样或o ng、5ng、10ng g/kg以下)，如测定，但不需重于小蒸发皿内挥按薄层层析法确化柱，去除脂肪、蛋白有荧光检测器的
21、液相12.6 乙精水(84+16)提取液:量取乙眉(分析纯)840mL，加水160mL，t:昆匀。12. 7 水乙睛(85+15)溶液:最取乙睛(色谱纯)150mL，加三蒸水850mL，混匀。12.8 标准储备液:分别准确称取黄曲霉毒素Bj、B2、Gj、G20.200 0 g、0.0500 g、0.2000 g、0.0500 g (精确至0.001g)，置10mL容量瓶中，加乙腊(分析纯)洛解，并稀释至刻度。此溶液密封后避光300C保存，两年有效。12.9 标准工作液:准确移取标准储备破1.00L，至10mL容量瓶中，加乙月部分析纯)稀释至刻度。GB/T 5009.23-2006 i比榕液密封
22、后避光40C保存，三个月有效。12. 10 标准系列溶液:准确移取标准工作液适量，至10mL容量瓶中，加乙腊(分析纯)稀释至刻度(含黄曲霉毒素BI、G1的浓度为0.00g/L、o.500 0g/L、1.000g/L、2.000g/L、5.000g/L、10. 00g/L、25.00g/L、50.00g/L、100.0g/L;黄曲霉毒素Bz、马的浓度为o.00g/L、0.125 0g/L、O.250 0g/L、O.500 0g/L、1.250g/L、2.500g/L、6.250g/L、12.50g/L、25.00g/L的系列标准榕液)，注意避光。仪器和设备液梧色谱系统(HPLC):附荧光检测器。
23、色谱柱:反相CI8柱，要求4种毒素的峰能够达到基线分离。含有反相离子交换吸附剂的多功能净化柱:Mycosep226MFC柱或Mycosep228MFC柱1)。电动振荡器。旋涡提合器。烘干箱。离心机。真空吹干机，或氮气及水浴锅。天平:感量为万分之一。13 13. 1 13.2 13.4 13. 7 13.8 13.5 13.6 13.3 13.9 分析步骤14. 1 试样提取称取20g经充分粉碎过的试样至250mL的三角瓶中，加入80mL乙睛水(84十16)提取液，在电动振荡器上振荡30min后，定性滤纸过滤，收集滤液。14.2 试梓净化移取约8mL提取液至多功能净化柱的玻璃管内，将多功能净化柱
24、的填料管插入玻璃管中并缓慢推动填料管，净化液就被收集到多功能净化柱的收集池中。14.3 试样衍生化从多功能净化柱的收集池内转移2mL净化液到棕色具塞小瓶中，在真空吹干机下600C土lOC吹干(或在600C水洛下氮气吹干，注意不要使液体鼓泡、飞攒)。加人200L正己烧和100L三氟乙酸，密闭混匀30s后，在400C土lOC烘干箱中街生15mino室温真空吹干机吹干(或室温水洛下氮气吹干)，以200L水-乙黯(85十15)溶解，混匀30s , l 000 r/min离心15min，取上清液至液相色谱仪的样品瓶中，供掘定用。14.4 标准系列溶液的制备吸取标准系列溶液各200L，在真空吹干机下600
25、C吹干(或在600C水浩下氮气吹干，注意不要使液体鼓梅、飞溅)，衍生化方法同14.3。14.5 测定14.5. 1 色谱条件色谱柱:12.5 cmX 2.1 mm，5m，C18。柱温:30oC。流动相:乙腊(色谱纯)，水，梯度洗脱的变化可参考表2。调整洗脱梯度，使4种黄曲霉毒素的保留时间在4min25 min。14 。rw露:32fjji-553;1) Mycosep226 MFC柱或Mycosep228MFC柱是由RomerLabs提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。6 时间/min0.00
26、 6.00 8.00 14.00 流速:0.5mL/min。进样量:25L。表2流动梧的梯度变化乙腊/c%)15.0 17.0 25.0 15.0 荧光检测器:激发波长:360nm;发射波长:440nm。14.5.2 测定GB/T 5009.23-2006 水/c%)85.0 83.0 75.0 85.0 黄白霉毒素按照G1、B1、G2、良的顺序出峰，以标准系列的峰面积对浓度分别绘制每种黄曲霉毒素的标准曲线。试样通过与标准色谱图保留时间的比较确定每一种黄曲霉毒素的峰，根据每种黄曲毒毒素的标准曲线及试样中的峰面积计算试样中各种黄曲霉毒素含量。14.6 结果计算按式。)计算样品中每种黄曲霉毒素的法
27、度:AXV C 工工mXf 式中:c一一试样中每种黄曲霉毒素的浓度，单位为微克每千克(g/kg); A一一试样按外标法在标准曲线中对应的浓度，单位为微克每升(g/L); V一一试样提取过程中提取液的体积，单位为毫升(mL);m一一试样的取样量，单位为克(g);f一一试样溶液衍生后较衍生前的浓缩倍数。计算结果表示到三位有效数字。15 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的相对偏差不得超过算术平均值的15%。16 黄曲毒毒素的色谱圈. ( 1 ) 当黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2含量分别为25.0g/L、6.25g/L、25.0g/L、6.25g/L时，产生的色谱图见图1，出峰顺序为G1、
28、B1、G2、丸。FLDl A, Ex =360 , Em=440 AFBj 16 AFB2 14 同CD 3 12 AFG j F6-3 4 -10 8 6 4 2 4 6 8 10 12 min 1 黄曲霉毒素的色谱盟UCONiR.80山H曲。华人民共和国家标准食品中黄曲霉毒素矶、岛、G1、G2的测定GB/T 5009.23-2006 国中* 中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销美印张0.75字数15千字2007年2月第一次印刷开本880X12301/16 2007年2月第一版定价10.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533头书号:155066 1-28833 GB/T 5009.23-2006
