1、ICS 67.040 C 53 国中华人民共和国国家标准食c 目口中烟G/T 5009.89-2003 代替GB/T12395一1990酸的测定Determination of niacin in foods 2003-08-11发布2004-01-01实施中华人民共和国卫生变发布中国国家标准化管理委员再GB/T 5009.89-2003 640 前言本标准对应于AOAC43.167-43.174(食物中烟酸的微生物测定法以1984年版。本标准与AOAC43. 167-43.174的一致性程度为非等效。本标准代替GB/T12395-1990(食物中烟酸的测定方法儿本标准与GB/T12395-1
2、990相比主要修改如下z修改了标准的中文名称，标准中文名称改为食品中烟酸的测定以按GB/T20001. 4-2001 (标准编写规则第4部分:化学分析方法对原标准的结构进行了修改。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位.中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所。本标准主要起草人王光亚、李小林、沈湘、石磊、杨晓莉。原标准于1990年首次发布，本次为第一次修订。GB/T 5009.89-2003 食品中烟酸的测定1 范围本标准规定了用微生物方法测定食品中的烟酸含量。本标准适用于各类食品中烟酸的测定。本方法检出限为10吨，线性范围为0.05gO.3问。2 原理某一种微生物的生长，必需某
3、种维生素，例如L.盯abinosus17-5之生长需要烟酸，培养基中若缺乏这种维生素该细菌便不能生长。在一定条件下，该细菌生长的情况，以及它的代谢物乳酸的浓度是与培养基中该维生素含量成正比的，因此可以用酸度或浑浊度的测定法来测定试样中烟酸的含量。3 试剂3.1 甲苯。3.2 3 mol/L盐酸溶液。3.3 2.4 mol/L盐酸溶液。3. 4 O. 5mol/L硫酸溶液。于2000mL的烧杯中先注入700mL水，将28mL硫酸沿烧杯壁慢慢倒入水中，用水稀释至1000mL. 3.5 O. 02 mol/L冰乙酸溶液。3.6 10 mol/L氢氧化锅溶液。溶200g氢氧化销于水中，稀释至500mL
4、。3. 7 O. 1 mol/L氢氧化纳溶液。溶4g氢氧化饷于水中，稀释至1000 mL。3.8 25%(体积分数)乙醇溶液。3.9 酷蛋白2不含维生素。3.9.1 不含维生素酷蛋白的制备。3.9. 1. 1 乙醇处理法z称取100g酶蛋白细粉子烧瓶中，加入300mL 95%乙醇，在水浴中加热回流1 h，减压抽滤，弃去滤液，再加入乙醇回流，如此反复3次4次，至滤液呈微黄色或无色，取出在烘箱内70C80C干燥即可。3.9. 1. 2 酸洗法:称取250g酶蛋白，置于5L容器中，慢慢加入3.6L水以防成块，加入浓盐酸2.77 mL，搅拌浸泡3mino用虹吸管除去上层清液。加人3.6L水，再加人浓硫
5、酸2.77mL，如此反复8次后，再加水3.6L，;l1O入55.5 mL 12 mol/L氨水，放置过夜，使酷蛋白溶解成浆状。用布过滤，于滤液中慢慢加入约50mL 3 mol/L盐酸，调至pH4.5，使酷蛋白全部沉淀，过滤。弃去滤液，用50C 60C热水冲洗数次.挤压去水，放入烤箱内于100C烤干即可。3.10 酸解酷蛋白.称取50g不含维生素的酷蛋白于500mL烧杯中，加200mL 3 mol/L盐酸，于压力蒸汽消毒器内10.3X 10 Pa压力下水解6儿将水解物转移至蒸发皿内，在沸水浴上蒸发至膏状。加200 mL水使之溶解后再蒸发至膏状，如此反复3次，以除去盐酸。注意每次蒸发时不可蒸干或使
6、之焦糊。用10mol/L氢氧化销调节pH值至3.5，以澳盼蓝作外指示剂。加20g活性炭，振摇，过滤。如果滤液不呈淡黄色或无色，可用活性炭重复处理。滤液加水稀释至500mL，加少许甲苯于冰箱中保存。3.11 生理盐水:取9g氯化纳溶于1000 mL的水中。每次使用时分别倒入6支8支10mL试管中，每支约加10mL，塞好棉塞，于压力蒸汽消毒器内6.9Xl0Pa压力下消毒15min，备用。3.12 脱氨酸、色氨酸溶液3称取4gL脱氨酸和1g L色氨酸溶于800mL水中，加热至70C80C， 641 GB/T 5009.89-2003 逐滴加入2.4mol/L盐酸，不断搅拌，直至完全溶解为止。冷至室温
7、，加水稀释至1000mL，加少许甲苯于冰箱中保存。3.13 腺嘿岭、鸟瞟岭(生化试Jlij)、尿略旋溶液z称取硫酸腺嗦岭(纯度为98%)、盐酸鸟嗦岭生化试剂、尿略院各O.lg，加75mL水和2mL浓盐酸，然后加热使其完全溶解，冷却，若有沉淀产生.加盐酸数漓，再加热。如此反复，直至冷却后元沉淀产生为止，用水稀释至100mL，加少许甲苯于冰箱中保存。3.14 0-泛酸钙、对氨基苯甲酸、盐酸毗哆醇溶液2称取D泛酸钙、对氨基苯甲酸、盐酸毗哆醇各10mg 于烧杯中，以水溶解并稀释至1000 mL，将此液置于棕色试剂瓶中，加少许甲苯于冰箱中保存。3.15 核黄素、盐酸硫胶素、生物素溶液:溶解1mg生物素结
8、晶于100mL 0.02 mol/L乙酸中，取此液4 mL(相当于40g生物素)于2000 mL烧杯中，加入20mg核黄素和10mg盐酸硫胶素，以0.02 mol/L乙酸溶解并稀释至1000mL。加少许甲苯于冰箱中保存，此试剂需保存于棕色瓶中，以防止核黄素被光破坏。3.16 甲盐溶液z称取25g磷酸氢二饵(K2HPO，)和25g磷酸二氢饵(KH2P，)，加水溶解后稀释至500 mL，加少许甲苯于冰箱中保存。3.17 乙盐溶液z称取10g硫酸筷(MgSO， 7H20人0.5g氯化锅、0.5g硫酸亚铁(FeSO，.7H20)和0.5日硫酸话(MnS， H2)，加水熔解后稀释至500mL，加5滴盐酸
9、，加少许甲苯于冰箱中保存。3.18 烟酸标准储备液(0.1mg/mLl准确称取50.0mg己干燥恒量并贮存于五氧化工磷干燥器中的烟酸标准品，以25%乙醇溶液溶解并定容至500mL，混匀，于冰箱中保存。此溶液每毫升相当于100问烟酸。3.19 烟酸标准中间液(1g/mL)，吸取1.00 mL烟酸标准储备液，置于100mL容量瓶中，用25%乙醇溶液定容，混匀，于冰箱中保存。此溶液每毫升相当于1E烟酸。3.20 烟酸标准使用液(0.1问/mL)，1惦用时吸取5.00mL烟酸标准中间液，置于50mL容量瓶中，用水定容，混匀。此溶液每毫升相当于0.1月烟酸。3.21 基本培养基储备液:将下列试剂混合于5
10、00mL烧杯中，加水至450mL，用10mol/L氢氧化纳溶液调节pH至6.8，以澳膀香草盼蓝作外指示剂，用水稀释至500mL, 酸解酷蛋白50 mL 脱氨酸、色氨酸溶液50 mL 腺嗦玲、鸟瞟岭、尿略皖溶液10 mL D泛酸钙、对氨基苯甲酸、口比哆醇溶液10 mL 核黄素、盐酸硫胶素、生物素溶液10 mL 甲盐溶液10 mL 乙盐溶液10 mL 元水葡萄糖10 g 元水乙酸纳10 g 3.22 琼脂培养基:将下列试剂混合于250mL三角瓶中，加水至100mL，于水浴上煮至琼脂完全溶化，以澳靡香草盼蓝为外指示剂，用1mol/L盐酸趁热调节pH至6.8，尽快倒入试管中，每管3mL 5mL.塞好棉
11、塞，于压力蒸汽消毒器内6.9X10 Pa压力下灭菌15min，取出后竖直试管，待冷至室温，于冰箱中保存。无水葡萄糖1. 0g 乙酸销(NaAc3H2) 1. 7g 蛋白陈(生化试JliJ)0.8 g 酵母提取物于粉(生化试剂)0.2 g 甲盐溶液0.2 mL 乙酸溶液0.2 mL 642 GB/T 5009.89-2003 琼脂(细菌培养)1. 2 g 3.23 1 g/L澳盼蓝乙醇溶液。称取0.1g澳酣蓝，用乙醇0+3)溶解后，再加乙醇稀释至100mL, 3.24 0.4 g/L澳庸香草盼蓝溶液z称取0.1g澳靡香草盼蓝于小研钵内，加1.6 mL O. 1 mol/L氢氧化销研磨，加小量水继
12、续研磨，直至完全溶解，加水稀释至250mL。3.25 0.4 g/L澳甲盼绿溶液。称取0.1g澳甲盼氯于小研钵中，加1.4 mL O. 1 mol/L氢氧化销研磨，加少许水继续研磨，直至完全溶解，用水稀释至250mL。3.26 澳庸香草盼蓝，0.01g/L溶液，量取25mL 0.4 g/L澳靡香草盼蓝溶液，加水稀释至1000 mL. 供滴定用。4 仪器4.1 实验室常用设备。4.2 电热恒温培养箱。4.3 压力蒸汽消毒器。4.4 液体快速混合器。4.5 离心机。4.6 硬质玻璃试管，20mmX150 mm。5 菌种与培养液的制备与保存5.1 储备菌种的制备:以阿拉伯乳酸杆菌(Lactobaci
13、llusarabinosus 17-5 ATCC No. 8014.简称L.A.) 纯菌种接入2个或多个琼脂培养基管中，在37(:士0.5C恒温箱中保温16h24 h.取出于冰箱中保存，不超过两周。保存数周以上的储备菌种，不能立即用作制备接种液之用，应在使用前每天移种一次，连续两至三天，方可使用。5.2 种子培养液的制备z加5mL 0.1g/mL烟酸标准使用液和5mL基本培养基储备液于一15mL 离心管中，寨好棉塞，于6.9X 104 Pa压力下灭菌15min，取出，于冰箱中保存每次制备2管4管，备用。6 分析步骤6.1 接种液的制备使用前一天，将L.A.菌种由储备菌种管移种于已消毒的种子培养
14、液中。在37(:士0.5C恒温箱中保温16h24 h.取出离心10min(3 000 r/min).倾去上部液体，用巳灭菌的生理盐水淋洗2次，再加10 mL灭菌生理盐水，将离心管置于液体快速混合器上混合，使菌种成混悬体，将此液倒人已灭菌的注射器内，立即使用。6.2 试样制备从均匀试样(0.200 g 10.000 g)中称取含烟酸约5月50吨(用千分之一天平称量).置于100 mL三角瓶中，加50mL O. 5 mol/L硫酸，混匀，于10.3XI0生Pa压力下水解30mn，取出冷至室温，用10mol/L氢氧化纳溶液调节pH至4.5.以澳甲盼绿为外指示剂。将水解液移至100mL容量瓶中，定容，
15、过滤。脂肪含量高的试样，用无水乙商量提取以除去脂肪。此试样水解液可在4C冰箱中保存数周。取适量水解液于25mL具塞刻度试管中，用0.1mol/L氢氧化销调节pH至6.8.以澳蔚香草盼蓝作外指示剂，用水稀释至刻度，使溶液中烟酸含量约为50ng/mL.此液为试液。6.3 试液管的制备每支试管中分别加入1.0、2.0、3.0、4.0mL试祥试液，需做两组。每管加水稀释至5mL，再加入5 mL基本培养基储备液。643 GB/T 5009.89-2003 6.4 标准臂的制备每支试管中分别加入烟酸标准使用液。、0.5、1.0、1.5, 2. 0、2.5、3.0mL.需做三组。每管加水稀释至5mL.再加人
16、5mL基本培养基储备液。6.5 灾菌试样管和标准管均用棉塞塞好，于6.9X 10 Pa压力下灭菌15min, 6.6 接种和培养待试管冷至室温后，每管接种一滴种子液，于37C士0.5C恒温箱中培养约72h , 6.7 i商定将试管中培养液倒入50mL三角瓶中，用5mL O. 04 g/L澳蔚香草盼蓝溶液分两次淋洗试管，洗液倒入该三角瓶中，以0.1mol/L氢氧化铀溶液滴定，呈绿色即为终点，其pH约为6.8，7 结果计算式中:x = cVF X .100 一-_.二m 1 000 X 试样中烟酸的含量，单位为毫克每百克(mg/100g); C-每毫升试样液中烟酸含量的平均值，单位为微克每毫升(g/mL); V 试样水解液定容总体积，单位为毫升(mL);F 试样液的稀释倍数pm 试样质量，单位为克(g);100 一-一折算成每100g试样中烟酸毫克数的换算系数。1000 .O 计算结果表示到小数点后两位。8 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。644
