1、G8/T 54 13. 2-1997 前言本标准参考了日本森永公司的乳清蛋白测定方法。本系列标准从实施之日起，代替GB5413-85。本标准由中国轻工总会提出。本标准由全国乳品标准化中心归口。本标准负责起草单位2哈尔滨森永乳品有限公司、国家乳制品质量监督检验中心。本标准参加起草单位z卫生部食品卫生监督检验所、浙江省轻工业研究所、雀巢(中国投资服务有限公司.本标准主要起草人z于丽坤、张燕杰、赵勤。 225 ,-中华人民共和国国家标准婴幼儿配方食品和乳粉乳清蛋白的测定Milk powder and formula foods for infant and young children -Deter
2、mination of whey proteln 1 范围本标准规定了酶蛋白与乳清蛋白含量比率的测定方法。GB/T 5413.2-1997 代替GB5413-85 本标准适用于婴幼儿配方食品和乳粉中酷蛋白与乳清蛋白含量比率的测定。2 方法提要试样用SDS-聚苯烯默默凝胶电泳(SDS-PAGE，Laemmli法)后，用光密度计对按分子量顺序分离开的酷蛋白与乳清蛋白各谱带进行测定，求得酶蛋白与乳清蛋白的含量比率。3试J所有试剂，如未注明规格，均指分析纯g所有实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。3. 1 电泳缓神液z将Tris(hydroxymethyl )aminomethane7.挝、甘胶酸
3、36g、SDS2.5g溶于蒸馈水中，定容至500mLo使用前以蒸馆水稀释5倍后使用。3. 2 SDS试样缓冲液，0.125mol/L Trs卜盐酸(pH6.剖，体积分数20%的甘泊，4%(m/V)SDS，体积分数10%2-mercaptoethanol，质量分数0.0025%的澳盼蓝(bromophnolblue)。3. 3 染色剂z质量分数0.1%考马斯蓝R-250(Coomassiebrilliant blue R-250)，体积分数10%的甲醇，体积分数7.5%的乙酸。3.4 脱色JfiJ，体积分数10%的甲醇，体积分数7.5%的乙酸。3.5 酷蛋白。3.6精制乳清蛋白(W配)03.7
4、SDS-PAGE，用梯度凝胶(lO%20%)或同效凝胶。4 仪器常用实验室仪器及24. 1 平板式电泳槽。4.2 供电设备。4.3 光密度计。5 操作步骤5. 1 样液的制备将试剂按蛋白质1020问/L的浓度范围溶解在蒸馆水中。加入与试样同体积的SDS试样缓冲画东技术监督局1997-05-28批准1998-09-01实施226 GB/T 5413. 21997 液，在煮沸热水中静置5min后，作为试样液。5.2 标准溶液的制备使用前.酷蛋白和乳清蛋白的蛋白质浓度按凯氏(Kjeldahll法精确测定。将酶蛋白和乳清蛋臼按上述方法分别进行溶解和处理后作为标准溶液。此外，还可将酶蛋白与乳清蛋白的标准
5、溶液按蛋白质含量的任意比率(比如蛋白质的浓度比为7525.50 50.25 75)进行混合作为混合标准溶液.5.3 电泳将凝胶设置在电泳槽中，加入电泳缓冲液。试样溶液与标准溶液的添加量为每孔10L。电泳时间因电泳凝胶的种类不同而异。以10%20%的梯度复合凝胶进行电泳时，定电流为40mA.时间为60min，电泳结束时间可按澳盼蓝的蓝谱带到达离凝胶下端5mm时为标志。电泳结束后将凝胶放入染色液中振荡染色lh.然后转入脱色液中振荡脱色12h再移到蒸饿水中。5. 4 测定以光密度计对带色的各谱带进行测定，求得其颜色深度WD)的积分值(=Trace值)。6 分析结果的寝述6. 1 谱带的测定电泳后的谱
6、带中，参照分子量以及标准酶蛋白与乳清蛋白的电泳图，分别选择以下谱带进行计算。(1)酷蛋白:叫酶蛋白(分子量23500)，-酷蛋白(分子量24000).酶蛋白(分子量19000);(2)乳清蛋白.乳白蛋白(分子量14000).自-乳球蛋白(分子量18000).血清白蛋白分子量66000)。6.2 it算方法将以上三种酷蛋白谱带的Trace值合汁，再除以该条泳线中所有谱带的Trace值的总和，求得酷蛋白的比率(Cj值)。以同样方式将以上三种乳清蛋白谱带的Trace值合计，再除以该条泳线中所有谱带Trace值的总和，求得乳清蛋白的比率(Wj值)。当以酷蛋白与乳清蛋白的单独溶液为标准溶液时，按以上方法
7、分别求得标准酷蛋白的Cj值(=C.值与标准乳清蛋白的Wj值(=W，值)。将试样的Cj值与Wj值分别除以C，值与W.值，求得暂定的酶蛋白含量比率(C，值)与乳清蛋白的含量比率(W，)。当C，ji直+W2值不等于1时，将C，值、W，值分别除以C，值与W，值的总和进行补整，求得试样中的酷蛋白以及乳清蛋白的比率。当以黯蛋白与乳清蛋白的混合溶液为标准溶液时，按以上方法分别求得各混合比率中酶蛋臼的Cj值与乳清蛋白的Wj值。将混合标准溶液的C值与黯蛋白含量比，以及Wj值与乳清蛋白含量比做成坐标检量线，利用该检量线求得试样的C，值与W，值。当C，值+W，值不等于l时，将C，值、W，值分别除以C，值与W，值的总和进行补整，求得试样中酷蛋白以及乳清蛋白的比率。227
