1、ICS 67.040 B 20 中华人民=H工/、和国国家标准GB/T 5521-2008 代替GB/T5521一1989-淀粉酶粮油检验谷物及其制品中活性的测定比色法Inspection of grain and oils-Determination of alpha-amylase activity in cereal and cereal products-Colorimetric method 2008-11-04发布中华人民共和国国家质量监督检验检茂总局中国国家标准化管理委员会2009-01-01实施发布G/T 5521-2008 剧昌本标准是对GB/T5521一1989(谷物和谷物
2、产品-淀粉酶活性的测定比色法的修订。本标准代替GB/T5521 19890 本标准与GB/T5521-1989相比主要变化如下:一一一增加了规范性引用文件;一一对术语和定义进行了修改;一一一增加了对测试报告的要求;一一将计算举例由正文调至附录，作为资料性附录。本标准的附录A为资料性附录。本标准由国家粮食局提出。本标准由全国粮油标准化技术委员会归口。本标准起草单位:南京财经大学。本标准主要起草人:鞠兴荣、王素雅、袁建、杨慧辞。本标准所代替标准的历次版本发布情况为:一一一GB/T5521-1985、GB/T5521-19890 I GB/T 5521-2008 1 范围粮油检验谷物及其制品中-淀粉
3、酶活性的测定比色法本标准规定了比色法测定谷物及制品中-淀粉酶活性的术语和定义、原理、试剂和材料、仪器、操作步骤、结果计算、精密度和测试报告。本标准适用于测定谷物和谷物产品r淀粉酶活性，也可用于测定源于真菌和细菌的r淀粉酶干粉的活性。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682-2008 ,IS0 3696
4、 :1 987 ,MOD) 3 术语和定义下列术语与定义适用于本标准。3. 1 fJ-极限糊精fJ-limit dextrins 能被卢-淀粉酶完全降解的淀粉产物。3.2 酶活力单位enzymic activity 1 L溶剂从1g样品中所提取的酶，在规定条件下，每秒钟降解1.024 X 10-5单位的卢极限糊精底物溶液，该样品的-淀粉酶活力为1个单位。4 原理-淀粉酶降解卢-极限糊精底物溶液，在酶促反应进程中，分别在不同时间将反应混合物等分加到殃溶液中。随着反应时间的延长，反应混合物与映液的显色强度降低，以测定酶活性。5 试剂和材料除非另有说明，所用试剂均为分析纯。实验用水符合GB/T668
5、2中三级水的要求。5. 1腆。5.2 腆化御。5.3 氯化钙。5.4 元水乙酸锅。5.5 硫酸。5.6 冰乙酸。5. 7 可溶性淀粉。注:可采用Lintner淀粉或质量相当的国产可溶性淀粉。1 GB/T 5521-2008 5.8 浮石粉。5.9 腆贮备液:称取11.0 g映化饵溶于少量水中，加5.50g结晶腆，搅拌至映完全溶解。再定容至250 mL，置于棕色瓶中，在暗处贮存，此溶液可保存一个月。5.10 腆稀释液:称取40.0g腆化饵溶于水中，加4.00mL腆贮备液，并稀释至1L，用时现配，不可过夜。5. 11 硫酸溶液:c(H2S04)= 0.05 mol/Lo 5.12 缓冲液:称取16
6、4g元水乙酸锅溶于水中，加入120mL冰乙酸，用水定容至1L。5.13 氯化钙溶液:c(CaClz) =0. 2%。5.14卢-淀粉酶溶液z称取10g有酶活性的黄豆粉(粗细度为通过1.5 mm孔筛)，加入85mL水和15 mL o. 05 mol/L硫酸(5.11)充分搅匀，静置15min，抽滤，该滤液即为卢-淀粉酶溶液。5.15卢-极限糊精溶液:称取5.00g(干基)可溶性淀粉于小烧杯中，加入约20mL 71混匀，将其边搅拌边缓慢倒入盛有100mL沸水的500mL高型烧杯(6.6)中，并用洗瓶将小烧杯中的淀粉全部转移至高型烧杯中，继续搅拌并加热，缓慢煮沸2mino加盖表面皿，在自来水中冷却至
7、300C以下，加入25mL 缓冲溶液(5.12)及50mL -淀粉酶溶液(5.14)，在室温下放置20h，加入1勺浮石粉，将此溶液在10 min之内缓慢煮沸，然后继续沸腾5min以上。冷却至300C以下，用水定容至250mL，摇匀，过滤。滤液中加几滴甲苯，此溶液的pH值应为(4.7士0.1)，在25c以下可连续使用5天。6 仪器6. 1 恒温水浴:300C士0.1oC与200C士0.1oC各1台。6.2 分光光度计或比色计。6.3 秒表。6.4 筛:孔径为1.0mm、1.5 mm。6.5 pH计。6.6 烧杯及高型烧杯:100mL、250mL、500mL。6. 7 容量瓶:250mL、1000
8、 mL。6.8 锥形瓶:300mLo 6.9 移液管:5mL、20mLo 6. 10 分析天平:分度值0.01g。7 操作步骤7. 1 分光光度计及其空白调整将分光光度计(6.2)连接稳压电源，预热20min，调整波长为575nm。将2.0mL氯化钙溶液(5. 13)加到10.0mL殃稀释液(5.10)中，然后以适量的水(Vo)稀释(加水量一般为20mL-40 mL, Vo 详见7.2)，混匀后置于200C水浴中，用1cm比色皿进行测试，调节仪器狭缝宽度，使吸光度为零。7.2 底物溶液的校准分别吸取5.0mL极限糊精溶液(5.15)和15.0mL氯化钙溶液(5.13)于一个100mL烧杯(6.
9、6) 中，混匀。取出2.0mL混合液至另一个100mL烧杯(6.6)中，加入10.0mL腆稀释液(5.10)和适量的水，混匀后置于20oC水浴中，用1cm比色皿在波长575nm处，以7.1所用溶液为参比，测其吸光度。调整加水量，使测得的吸光度在O.55-0. 60之间，如果测得吸光度大于O.60则增大加水量，如果测得值少于0.55则减少加水量。通过反复试配，直至测定的吸光度值在O.55-0. 60之间，记下此时的加水量(Vo)，并用它调整空白溶液的加水量，V。即为该极限糊精测试时的加水量。7.3 提取称取谷物样品约5g(精确到0.05g)，倒入300mL锥形瓶中，加入预热到30oC的氯化钙溶液
10、2 GB/T 5521-2008 (5.13)100 mL:f: O. 5 mL，充分摇匀，置于300C的恒温水浴中。在15min、30min、45min时从水浴中取出，上下颠倒锥形瓶(6.8)10次，重新置于水浴，共提取60mino取出锥形瓶并过滤，滤液即为-淀粉酶的提取液。7.4 活性测定将-淀粉酶提取液和卢极限糊精溶液置于300C水浴中预热，10min后用快速移液管吸移5.0mL 极限糊精溶液(5.15)至盛有15.0mL酶提取液(7.3)的锥形瓶中，加塞后摇匀。在加液的同时，用秒表计时。吸取10.0mL稀腆溶液(5.10)于各个50mL容量瓶(6.7)中，加人民mL水(7.2) ，混匀
11、加塞后置于20oC水浴中，每隔5min或10min进行下列操作:a) 吸取2.0mL酶、极限糊精混合液(7.4)到一个盛有稀腆溶液和VomL水的容量瓶中，摇匀后置于200C水浴中，使混合溶液温度达到20oC; b) 倒人比色皿测其吸光度。8 结果计算试样的-淀粉酶活性按式。计算:式中:A = 500 X f x _ 100 . X 19D1 -lgD2 = 500 X f X b)( _!Q_Q 一一一一一一m 100一h t1一t乌2m 100一hA一-a-淀粉酶活性，以U(单位)计;m -100 mL氯化钙提取的试样质量，单位为克(g); k一一试样中水分含量(以质量分数计),%; f一一
12、酶提取液的稀释倍数;tl ，t2一-一不同的反应时间，单位为分(min); 矶、D2一一时间t1，t2时的吸光度;b一一-lgD对t曲线的斜率的绝对值;500-系数。9 精密度同一样试样，在同一实验室同时或连续两次测定结果之差，不得超过平均值的10%，如果两次测定结果符合要求，则取结果的平均值。按表1修约z表1结果表示方式活性/U(单位)修约成整数范围/U(单位50 0.1 50500 1 5005 000 10 5 00050 000 100 注1:测定过程中应合理调整酶的浓度，使35%60%的极限糊精在15min内降解，即最后测得的吸光度为底物校准时吸光度的40%65%。如果吸光度降得太快
13、，则酶液可用0.2%的氯化钙溶液再稀释。如酶的活性太低，为获得正确结果，可将反应时间延长到60min以上。注2:用分光光度计测定吸光度时，溶液温度对结果有影响，必须控温在20c。在7.4的操作中，从显色到测定吸光度的问隔时间一般对结果没有影响，如测定一系列样品，可在所有样品均完成显色后再一起测定吸光度。但最长间隔时间不得超过1h。10 测试报告测试报告应详细说明:3 GB/T 5521-2008 4 一一包括鉴定样品所必需的全部信息;一一若已知采样方法，则注明;一一一本标准中没有具体说明的、或者被认为是可选的，以及所有可能影响实验结果的操作细节;一一所得的测定结果;一一-如进行了重复性试验，列
14、出结果。附录A(资料性附录)计算举例G/T 5521-2008 含14.2%水分的样品5.20g，用100mL氯化钙溶液(5.13)提取。由于酶提取液与极限糊精的反应速度太快，故用氯化钙溶液稀释酶提取液，1份酶提取液(7.3)加1.5份氯化钙溶液(5.13)。因此f=l+1. 5=2. 5。极限糊精与酶提取液混合后，间隔5min、10min和20min后，吸光度分别如表A.1所示:表A.1不同反应时间后的眼光度时间/min吸光度D19D十15 0.498 0.697 10 0.425 0.628 20 0.308 0.489 根据5min和10min后的观察结果:0.697一0.628b v.
15、 v oJ_ v_. V L.IJ =0.013 8 min-1 10-5 把b=O.013 8代人式。)得z500X2. 5XO. 013 8 100 A=._:.VVX_ 3.9U 5. 20 100-14. 2 如用三个观察结果作IgD+1对t的曲线(见图A.1)，得b=O.013 9 0 19D+1 0.75 0.7 y=-D. 013 9x+0. 7665 0.65 0.6 0.55 0.5 0.45 0.4 0 5 10 15 20 25 时间tlmin图A.15 GB/T 5521-2008 参考文献lJ ISO 3983: 1977 Method for determinati
16、on of alpha-amylase activity in cereal and cereal products-Colorimetric method. 2J GB/T 5521-1989 谷物和谷物产品-淀粉酶活性的测定比色法.3J GB/T 6682-1992 分析实验室用水规格和试验方法.4J GB/T 601 化学试剂标准滴定溶液的制备.5J GB/T 1. 1-2000 标准化工作导则第1部分:标准的结构和编写规则.6J GB/T 20001. 4-2001 标准编写规则第4部分z化学分析方法.7J ISO 5725-1: 1994 Accuracy (trueness and
17、 precision) of measurement methods and results-Part 1: General principles and definitions. 8J ISO 5725-2: 1994 Accuracy( trueness and precision)of measurement methods and results Part 2: Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measure ment method. 6 OON-N山问阁。华人民共和国家标准粮油检验谷物及其制品中岳淀粉酶活性的测定比色法GB/T 5521一2008国中骨中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销印张O.75 宇数12千字2009年1月第一次印刷* 开本880X12301/16 2009年1月第一版* 定价14.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533书号:155066 1-35466 GB/T 5521-2008
