1、ICS 13.060 c 51 中华人民共和国国家标准GB/T 5750.12-2006 部分代替GB/T5750一1985生活饮用水标准检验方法微生物指标Standard examination methods for drinking water Microbiological parameters 2006-12-29发布中华人民共和国卫生部也t中国国家标准化管理委员会品叩2007-07-01实施GB/T 5750.12-2006 目次前言.”.”.I 1 菌落总数.1 2 总大肠菌群.3 3 耐热大肠菌群.14 4 大肠埃希氏菌.16 5 贾第鞭毛虫.196 隐袍子虫.30前言GB/T
2、 5750生活饮用水标准检验方法分为以下部分：总则s一一水样的采集和保存；水质分析质量控制：感官性状和物理指标；元机非金属指标；一一金属指标；一一有机物综合指标$有机物指标；农药指标；一一消毒副产物指标号一一消毒剂指标；一一微生物指标；一一放射性指标。GB/T 5750.12-2006 本标准代替GB/T5750 1985生活饮用水标准检验法第二篇中的细菌总数、总大肠菌群。本标准与GB/T5750 1985相比主要变化如下：依据GB/T1. 1 2000标准化工作导则第1部分z标准的结构和编写规则调整了结构；增加了生活饮用水中耐热大肠菌群、大肠埃希氏菌、贾第鞭毛虫、隐于包子虫4项指标的7个检验
3、方法。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准负责起草单位：中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所。本标准参加起草单位：中山大学、黑龙江省疾病预防控制中心、河北省疾病预防控制中心、北京市疾病预防控制中心、深圳市疾病预防控制中心、澳门自来水公司、广州市自来水公司。本标准主要起草人2金银龙、陈西平、周淑玉、孙宗科、宋宏。本标准参加起草人遇晓杰、张淑红、张雅捷、丁培、薛金荣、余淑苑、范晓军、章诗芳。本标准于1985年8月首次发布.4: i）；为第一次修订。1 茵落总费生1. 1 平皿计数法1. 1. 1 范围生活饮用水标准检验方法微生物指标本标准规定了用平皿计数法测定生活饮用水及其水源水
4、中的菌落总数。本法适用于生活饮用水及其水源水中菌落总数的测定。1. 1. 2 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。1. 1. 2. 1 菌落总数standard plate-count bacteria GB/T 5750. 12-2006 水样在营养窃、脂上有氧条件下37培养48h后，所得1mL水样所含菌落的总数。1. 1. 3 培养基与试剂1. 1. 3. 1 营养琼Ii1. 1. 3. 1. 1 成分2A 蛋白陈10 g B 牛肉膏3 g c 氯化铀5 g D 琼脂10 g 20 g E 蒸馆水1 000 mL 1. 1. 3. 1. 2制法z将上述成分混合后，加热溶解，调整pH为7.
5、4 7. 6，分装于玻璃容器中（如用含杂质较多的琼脂时，应先过滤），经103.43 kPa 021，15 lb）灭菌20min，储存于冷暗处备用。1. 1. 4 仪器1. 1. 4. 1 高压蒸汽灭茵器。1. 1. 4. 2 干热灭菌箱。1. 1. 4. 3 培养箱36士l。1. 1.4.4 电炉。1. 1. 4. 5天平。1.1.4.6 冰箱。1. 1. 4. 7 放大镜或菌落计数器。1. 1. 4. 8 pH计或精密pH试纸。1. 1. 4. 9 灭菌试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管、采样瓶等。1. 1. 5 检验步骤1. 1. 5. 1 生活饮用水1. 1. 5. 1. 1 以无菌操作
6、方法用灭菌吸管吸取lmL充分混匀的水样，注入灭菌平皿中，倾注约15mL 已融化并冷却到45左右的营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿，使水祥与培养基充分混匀。每次检验时应做一平行接种，同时另用一个平皿只倾注营养琼脂培养基作为空白对照。1. 1. 5. 1. 2 待冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于36土1培养箱内培养48h，进行菌落计数，GB/T 5750. 12-2006 即为水样ImL中的菌落总数。1. 1. 5. 2 水源水1. 1. 5. 2. 1 以无菌操作方法吸取lmL充分混匀的水样，注入盛有9mL灭菌生理盐水的试管中，混匀成1: 10稀释液。1. 1. 5. 2. 2 吸取110的
7、稀释液ImL注人盛有9mL灭菌生理盐水的试管中，混匀成I 100稀释液。按同法依次稀释成1: I 000, I I 0 000稀释液等备用。如此递增稀释一次，必须更换一支ImL 灭菌吸管。1. 1. 5. 2. 3 用灭菌吸管取未稀释的水样和2个3个适宜稀释度的水样lmL，分别注入灭菌平皿内。以下操作同生活饮用水的检验步骤。1.1.6.菌落计数及报告方法作平皿菌落计数时，可用眼睛直接观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平皿的菌落数后，应求出同稀释度的平均菌落数，供下一步计算时应用。在求同稀释度的平均数时，若其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀
8、释度的平均菌落数。若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半皿计数后乘2以代表全皿菌落数。然后再求该稀释度的平均菌落数。1. 1. 7 不同稀释度的选择及报告方法1.1.7.1 首先选择平均菌落数在30300之间者进行计算，若只有个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则将该菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1中实例I）。1. 1. 7.2 若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30300之间，则视二者之比值来决定，若其比值小于2应报告两者的平均数（如表1中实例2）。若大于2则报告其中稀释度较小的菌落总数（如表1中实例3）。若等于2亦报告其中稀释度较小的菌落数（见表1中实例4）。1
9、.1.7.3 若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1中实例5）。1.1.7.4若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应以按稀择度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表l中实例6）。1. 1. 7.5 若所有稀释度的平均菌落数均不在30300之间，则应以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1中实例7）。1. 1. 7.6 若所有稀释度的平板上均无茵落生长，则以未检出报告之。1.1.7.7 如果所有平板上都菌落密布，不要用“多不可计”报告，而应在稀释度最大的平板上，任意数其中2个平板Icm2中的商落数，除2求出每平方厘米内平
10、均菌落数，乘以皿底面积63.6 cm2，再乘其稀释倍数作报告。1.1.7.8 菌落计数的报告菌落数在100以内时按实有数报告，大于100时，采用两位有效数字，在两位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算，为了缩短数字后面的零数也可用10的指数来表示（见表1“报告方式”栏）。表1稀释度选择及菌落总数报告方式不同稀释度的平均菌落数两个稀释度菌落总数实例菌落数之比(CFU/mL) 报告方式（CFU/mL)10 : 10 2 10 I I 365 164 20 16 400 16 000或I.6 JO 2 2 760 295 46 I. 6 37 750 38 0口。或3.8 JO 3 2 890 2
11、71 60 2. 2 27 JOO 27 000或2.7X 10 4 150 30 8 2 I 5口3I 500或I.5 JO 2 GB/T 5750. 12-2006 表1（续）不同稀释度的平均菌落数两个稀释度菌落总数实例菌落数之比(CFU/mL) 报告方式（CFU/mL)10- 10 10 5 多不可计I 650 513 513 000 510 000或5.I JO 6 27 11 5 270 270或2.7 JO 7 多不可计305 12 30 500 31 000或3.I 10 2 总大肠菌群2. 1 多管发酵法2. 1. 1 范围本标准规定了用多管发酵法测定生活饮用水及其水源水中的总
12、大肠菌群。本法适用于生活饮用水及其水源水中总大肠菌群的测定。2. 1. 2 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2. 1. 2. 1 总大肠菌群total coliforms 总大肠菌群指一群在37培养24h能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性元芽抱杆菌。2. 1. 3 培养基与试剂2. 1. 3. 1 乳糖蛋白陈培养液2. 1. 3. 1. 1 成分A 蛋白陈B 牛肉膏C乳糖D氯化纳10 g gbpbo6 355 E 澳甲盼紫乙醇溶液(16g/L) 1 mL F蒸馆水1 000 mL 2. 1. 3. 1. 2 制法将蛋白陈、牛肉膏、李L糖及氯化销溶于蒸馆水中，调整pH为7.2
13、7.4，再加入1mL16g/L的澳甲盼紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，68.95 kPa 015，10 lb）高压灭菌20min，贮存于冷暗处备用。2. 1. 3. 2 二倍浓缩乳糖蛋白膝培养液按上述乳糖蛋白豚培养液（2.1. 3. 1），除蒸馆水外，其他成分量加倍。2. 1. 3. 3 伊红美蓝培养基2. 1 3. 3. 1 成分A 蛋白陈10 g B 乳糖10 g C磷酸氢二何2 g D琼脂20 g 30 g E 蒸馆水1 000 mL F伊红水溶液（20g/L) 20 mL 3 GB/T 5750. 12-2006 G美蓝水溶液（5g/L) 13 mL 2. 1. 3. 3
14、. 2 制法将蛋白陈、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馆水中，校正pH为7.2.加入乳糖，混匀后分装，以68.95 kPa (115，10 lb）高压灭菌20min, I临用时加热融化琼脂，冷至5055，加入伊红和美蓝溶液，混匀，倾注平皿。2. 1. 3. 4 革兰民染色液2. 1. 3. 4. 1 结晶萦染色液A 成分a结晶紫1 g b 乙醇（95%，体积分数）20 mL c 草酸镀水溶液(10g/L) 80 mL B制法g将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸镀溶液混合。注2结晶紫不可用龙胆紫代替，前者是纯品，后者不是单一成分，易出现假阳性。结晶紫溶液放置过久会产生沉淀，不能再用。2. 1. 3. 4. 2
15、革兰氏慎液A成分Ea腆1g b 破化专甲2 g c蒸馆水300 mL B制法g将碗和腆化御先进行混合，加人蒸馆水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馆水。2. 1. 3. 4. 3 脱色剂乙醇（95%，体积分数）。2. 1. 3. 4. 4 沙黄复染液A 成分a 沙黄0. 25 g b 乙醇（95%，体积分数）10 mL c 蒸馆水90 mL B 制法z将沙黄溶解于乙醇中，待完全溶解后加入蒸馆水。2. 1. 3. 4. 5 染色法A将培养18h 24 h的培养物涂片。B将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min,Jj(洗。c 滴加革兰氏腆液，作用lmin，水洗。D i商加脱色剂，摇动玻片
16、，直至无紫色脱落为止，约30s ，水洗。E滴加复染剂，复染1min，水洗，待干，镜检。2. 1. 4 仪器2. 1. 4. 1 培养箱，36土1。2. 1. 4. 2 冰箱，o4。2. 1. 4. 3 天平。2. 1. 4. 4 显微镜。2. 1. 4. 5平皿直径为9cm, 2. 1. 4. 6 试管。2. 1. 4. 7 分度吸管：1mL, 10 mL, 4 2. 1. 4. 8 锥形瓶。2. 1. 4. 9小fiiJ管。2. 1. 4. 10 载玻片。2. 1. 5 检验步骤2. 1. 5. 1 乳糖发酵试验GB/T 5750.12-2006 2. 1. 5 . 1. 1 取10mL水祥
17、接种到10mL双料乳糖蛋白陈培养液中，取1mL水样接种到10mL单料乳糖蛋白陈培养液中，另取1mL水样注入到9mL灭菌生理盐水中，混匀后吸取lmL（即0.1mL水样）注入到10mL单料乳糖蛋白陈培养液中，每一稀释度接种5管。对己处理过的出厂自来水，需经常检验或每天检验一次的，可直接种5份10mL Jj(样双料培养墓，每份接神10mL水样。2. 1. 5. 1. 2检验水源水时，如污染较严重，应加大稀释度，可接种1,0.1,0.0lmL甚至0.1, 0. 01, 0. 001 mL，每个稀释度接种5管，每个水样共接种15管。接种1mL以下水样时，必须作10倍递增稀释后，取lmL接种，每递增稀释一
18、次，换用1支1mL灭菌刻度吸管。2. 1. 5. 1. 3 将接种管置36士1培养箱内，培养24h士2h，如所有乳糖蛋白豚培养管都不产气产酸，则可报告为总大肠菌群阴性，如有产酸产气者，则按下列步骤进行。2. 1. 5. 2 分离培养将产酸产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，于36土1培养箱内培养18h24h，观察菌落形态，挑取符合下列特征的菌落作革兰氏染色、镜检和证实试验。深紫黑色、具有金属光泽的菌落；紫黑色、不带或略带金属光泽的菌落；淡紫红色、中心较深的菌落。2. 1. 5. 3 证实试验经上述染色镜检为革兰氏阴性无芽抱杆菌，同时接种乳糖蛋白豚培养液，置36C土1培养箱中培养24h士2
19、h，有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在。2. 1. 6 结果报告根据证实为总大肠菌群阳性的管数，查MPN(most probable number，最可能数）检索表，报告每100 mL水样中的总大肠菌群最可能数CMPNJ值。5管法结果见表2,15管法结果见表3。稀释样品查表后所得结果应乘稀释倍数。如所有乳糖发酵管均阴性时，可报告总大肠菌群未检出。表2用5份10mL水样时各种阳性和阴性结果组合时的最可能数（MPN)5个10mL管中阳性管数最可能数（MPN)。16 5 GB/T 5750. 12-2006 褒3总大肠菌群MPN检索表（总接种量55.5 mL，其中5份10mL水样，5份lmL水样，
20、5份。.1mL水祥接种量mL总大肠菌群接种量mL总大肠菌群10 1 。.1 (MPN/100 mL) 10 1 。l(MPN/100 mL) 。l 600 8 2.2 滤膜法2. 2. 1 范围本标准规定了用滤膜法测定生活饮用水及其水源水中的总大肠菌群。本法适用于生活饮用水及其水源水中总大肠菌群的测定。2. 2. 2 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2. 2. 2. 1 总大肠菌群滤旗法membrane filter technique for total coliforms GB/T 5750. 12-2006 总大肠菌群滤膜法是指用孔径为0.45 m的微孔滤膜过滤水样，将滤膜贴在添加
21、乳糖的选择性培养基上37培养24h，能形成特征性菌落的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌以检测水中总大肠菌群的方法。2.2.3 培养基与试剂2. 2. 3. 1 晶红亚硫酸纳培养基2. 2. 3. 1. 1 成分A 蛋白陈B酵母浸膏c 牛肉膏D乳糖E 琼脂F磷酸氢二伺G 元水亚硫酸纳H 碱性品红乙醇溶液（50g/L) I 蒸馆水2. 2. 3. 1. 2 储备培养基的制备10 g 5 g 5 g 10 g 15 g 20 g 3. 5 g 5 g 20 mL 1 000 mL 先将琼脂加到500mL蒸馆水中，煮沸溶解，于另500mL蒸馆水中加入磷酸氢二仰、蛋白脉、酵母浸膏和牛肉膏，加热溶解，
22、倒人已溶解的琼脂，补足蒸馆水至1000 mL，混匀后调pH为7.2 7. 4，再加人乳糖，分装，68.95. kPa (115，10 lb）高压灭菌20min，储存于冷暗处备用。本培养基也可不加琼脂，制成液体培养基，使用时加2mL 3 mL于灭菌吸收垫上，再将滤膜置于培养垫上培养。2. 2. 3. 1. 3 平皿培养基的配制将上法制备的储备培养基加热融化，用灭菌吸管按比例吸取一定量的50g/L的碱性品红乙醇溶液置于灭菌全试管中，再按比例称取所需的无水亚硫酸饷置于另灭菌试管中，加灭菌水少许，使其溶解后，置沸水浴中煮沸10min以灭菌。用灭菌吸管吸取己灭菌的亚硫酸锅溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液至深
23、红色退成淡粉色为止，将此亚硫酸销与碱性品虹的混合液全部加到已融化的储备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡），立即将此种培养基15mL倾人已灭菌的空平皿内。待冷却凝固后置冰箱内备用。此种已制成的培养基于冰箱内保存不宜超过两周。如培养基已由淡粉色变成深红色，则不能再用。2.2.3.2 乳糖蛋白陈培养液同2.1. 3. 1。2.2.4 仪器2. 2. 4. 1 滤器。2.2.4.2 滤膜，孔径。45mo 2. 2. 4. 3 抽滤设备。9 GB/T 5750.12-2006 2. 2. 4. 4 元齿慑子。2.2.4.5 其他仪器同多管发酵法2.1. 4, 2.2.5 检验步骤2. 2. 5. 1
24、准备工作2. 2. 5. 1. 1 滤膜灭茵g将滤膜放入烧杯中，加入蒸馆水，置于沸水浴中煮沸灭菌3次，每次15min。前两次煮沸后需更换水洗涤2次3次，以除去残留溶剂。2. 2. 5. 1. 2 滤器灭菌2用点燃的酒精棉球火焰灭菌。也可用蒸汽灭菌器103.43 kPa (121，15 lb）高压灭菌20min, 2. 2. 5. 2 过滤水样用无菌慑子夹取灭茵滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在己灭菌的滤床上，固定好滤器，将100 mL水样（如水样含菌数较多，可减少过滤水样量，或将水样稀释）注入滤器中，打开滤器阀门，在5.07 10 Pa（负0.5大气压）下抽滤。2. 2. 5. 3培养水样滤完
25、后，再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器，用灭菌银子夹取滤膜边缘部分，移放在品红亚硫酸纳培养基上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者间不得留有气泡，然后将平皿倒置，放入37恒温箱内培养24h土2h, 2.2.6 结果观察与报告2. 2. 6. 1 挑取符合下列特征菌落进行革兰氏染色、镜检2紫红色、具有金属光泽的菌落；深红色、不带或略带金属光泽的菌落g淡红色、中心色较深的菌落。2. 2. 6. 1. l 凡革兰氏染色为阴性的元芽胞杆菌，再接种乳糖蛋白豚培养液，于37培养24h，有产酸产气者，则判定为总大肠菌群阳性。2. 2. 6. 1. 2 按式(1)计算滤膜上生长的总大肠菌群数，
26、以每lCOmL水样中的总大肠菌群数（CFU/100mL) 报告之。2.3 酶底物法2. 3. 1 范围总大肠菌群菌落数（CFU/100mU 数出的总大肠菌群菌落数100. ( 1 ) 过滤的水样体积（mL)本标准规定了用酶底物法测定生活饮用尔及其水源水中的总大肠菌群。本法适用于生活饮用水及其水源水中总大肠菌群的检测。本法可在24h判断水样中是否含有总大！说菌群及含有的总大肠菌群的最可能数CMPN）。本法可同时检测大肠埃希氏菌，见大场J主希氏菌检测（4.3）。2.3.2 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2. 3. 2. 1 总大肠菌群葡底物法enzyme substrate techniq
27、ue for total coliforms 总大肠菌群酶底物法是指在选择性培养基上能产生fl-半乳糖背酶（D-galactosidase）的细菌群组，该细菌群组能分解色原底物释放出色原体使培养基呈现颜色变化，以此技术来检测水中总大肠菌群的方法。2.3.3 培养基与试剂2. 3. 3. 1 培养基在本标准中酶底物法采用固定底物技术（DefinedSubstrate Technology.DST），本方法采用Minimal Medium ONPG-MUG (MMO-MUG）培养基，可选用市售商品化制品。每1000 mL MMO-MUG 10 培养基所含基本成分为2A硫酸镀(NH4)2SO,B硫酸
28、锺(MnSO,) C硫酸铐(ZnSO,) D硫酸续(MgSO,) E 氯化销(NaCl) F氯化钙(CaC!,) G亚硫酸销(Na, SO,) H 两性霉素B( Amphotericin B) I邻硝基苯RD-Pft喃半乳糖背23.0 13.5 2. 3. 6. 4 51孔定量盘法2. 3. 6. 4. 1 将培养24h之后的定量盘取出观察，如果孔穴内的水样变成黄色则表示该孔穴中含有总大肠菌群。2.3.6.4.2计算有黄色反应的孔穴数，对照表5查出其代表的总大肠菌群最可能数CMPN）。结果以MPN/100 mL表示。如所有孔未产生黄色，则可报告为总大肠菌群未检出。12 GB/T 5750.12
29、-2006 表551孔定量盘法不同阳性结果的最可能数（MPN）及95%可倍范围总大肠菌群95%可信范围阳性数(MPN/100 mL) 下限上限。2CD.5 表5（续）95%可信范围下限39. 7 42.0 44.6 47. 2 50.0 53. I 56.4 59. 9 63.9 68.2 73. I 78.6 85.0 92. 7 102. 3 115. 2 135.8 146. I 本标准规定了用多管发酵法测定生活饮用水及其水源水中的耐热大肠菌群。本法适用于生活饮用水及其水源水中耐热大肠菌群的测定。3. 1. 2 术语和定义下列术语和定义适用于本标准83. 1. 2. 1 耐热大肠菌群th
30、ermotolerant coliform bacteria 上限80. I 84. 4 88.8 93. 7 99,0 104.8 111. 2 118. 3 126. 2 135. 4 146.0 158. 7 174.5 195.0 224.1 272.2 387.6 用提高培养温度的方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分开，在44.5仍能生长的大肠菌群，称为耐热大肠菌群。3. 1. 3 培养基与试剂3. 1. 3. 1 EC培养基3. 1. 3. 1. 1 成分A膜蛋白陈20 g B乳糖5 g c 3号胆盐或混合胆盐1. 5 g D磷酸氢二饵4 g 14 GB/T 5750.
31、 12-2006 E磷酸二氢惆1. 5 g F氯化销5 g G蒸馆水1 000 mL 3. 1. 3. 1. 2 制法2将上述成分溶解于蒸馆水中，分装到带有倒管的试管中，68.95 kPa 015，10 lb）高压灭菌20min，最终pH为6.9土0.2。3. 1. 3. 2 伊红美蓝琼脂同2.1. 3. 3。3. 1. 4 仪器3. 1. 4. 1 恒温水浴，44.5士o.5或隔水式恒温培养箱。3. 1. 4. 2 其他同总大肠菌群多管发酵法（2.1.4.12.1. 4. 9）。3. 1. 5 检验步骤3. 1. 5. 1 自总大肠菌群乳糖发酵试验中的阳性管（产酸产气）中取1滴转种于EC培养
32、基中，置44.5 水浴箱或隔水式恒温培养箱内（水浴箱的水面应高于试管中培养基液面），培养24h士2h，如所有管均不产气，则可报告为阴性，如有产气者，则转种于伊红美蓝琼脂平板上，置44.5培养18h 24 h，凡平板上有典型菌落者，!l!U证实为耐热大肠茵群阳性3. 1. 5. 2 如检测未经氯化消毒的水，且只想检测耐热大肠菌群时，或调查水源水的耐热大肠菌群污染时，可用直接多管耐热大肠菌群方法，即在第一步乳糖发酵试验时按总大肠菌群2.1. 5. 1接种乳糖蛋白陈培养液在44.5士0.5水浴中培养，以下步骤同3.1. 5. L 3. 1. 6 结果报告根据证实为耐热大肠菌群的阳性管数，查最可能数（
33、MPN）检索表，报告每100mL水样中耐热大肠菌群的最可能数（MPN）值。3.2滤膜法3. 2. 1 范围本标准规定了用滤膜法测定生活饮用水及低浊度水源水中的耐热大肠菌群。本法适用于生活饮用水及低浊度水源水中耐热大肠菌群的测定。3.2.2 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3. 2. 2. 1 耐热大肠菌群滤膜法membrane filter technique for thermotolerant coliform bacteria 耐热大肠菌群滤膜法是指用孔径为0.45 m的滤膜过滤水样，细菌被阻留在膜上，将滤膜贴在添加乳糖的选择性培养基上，44.5培养24h能形成特征性菌落以此来检测
34、水中耐热大肠菌群的方法。3.2.3 培养基与试剂3. 2. 3. 1 MFC培养基3. 2. 3. 1. 1 成分A膜陈B多炼c 酵母浸膏D氯化纳E乳糖F 3号胆盐或混合胆盐G琼脂H 苯胶蓝I蒸馆水10 g 5 g 3 g 5 g 12. 5 g 1. 5 g 15 g 0. 2 g 1 000 mL 15 GB/T 5750.12-2006 3. 2. 3. 1. 2 制法在l000 mL蒸馆水中先加入玫红酸(IOg/L)的。.2 mol/L氢氧化销溶液10mL，混匀后，取500 mL加入琼脂煮沸溶解，于另外500mL蒸馆水中，加入除苯胶蓝以外的其他试剂，加热溶解，倒入已溶解的琼脂，混匀调p
35、H为7.4，加入苯胶蓝煮沸，迅速离开热源，待冷却至60左右，制成平板，不可高压灭菌。制好的培养基应存放于210，不超过佣人本培养基也可不加琼脂，制成液体培养基，使用时加2mL 3 mL于灭菌吸收垫上，再将滤膜置于培养垫上培养。3. 2. 3. 2 EC培养基同3.1. 3. 1。3.2.4 仪器3. 2. 4. 1 隔水式恒温培养箱或恒温水浴。3.2.4.2 玻璃或塑料培养皿：60mmX15 mm或50mmX12 mm, 3.2.4.3 其他仪器同2.2.4。3.2.5 检验步骤3. 2. 5. 1 准备工作同2.2. 5. 1。3.2.5.2过滤水样同2.2. 5. 2。3.2.5.3 培养
36、水样滤完后，再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器，用灭菌慑子夹取滤膜边缘部分，移放在MFC培养基上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者间不得留有气泡，然后将平皿倒置，放入44.5隔水式培养箱内培养24h土2h。如使用恒温水浴，则需用塑料平皿，将皿盖紧，或用防水胶带贴封每个平皿，将培养皿成叠封入塑料袋内，浸到44.5恒温水浴里，培养24h2 h，耐热大肠菌群在此培养基上菌落为蓝色，非耐热大肠菌群菌落为灰色至奶油色。3.2.5.4 对可疑菌落转种EC培养基，44.5培养24h士2h，如产气则证实为耐热大肠菌群。3.2.6 结果报告计数被证实的耐热大肠菌落数，水中耐热大肠菌群数系以10
37、0mL水样中耐热大肠菌群菌落形成单位（CFU）表示，见式（2）。所计得的耐热大肠菌菌落数100耐热大肠菌菌落数（CFU/100mU = 过滤的水样体积（mL)4 大肠埃希氏菌4. 1 多管发酵法4. 1. 1 范固本标准规定了用多管发酵法测定生活饮用水及其水源水中的大肠埃希氏菌。本法适用于生活饮用水及其水源水中大肠埃希氏菌的测定。4. 1. 2 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。4. 1. 2. 1 大肠埃希氏菌多雷发酵法multiple tube fermentation technique for Escherichia coli ( 2 ) 大肠埃希氏菌多管发酵法是指多管发酵法总大肠
38、菌群阳性，在含有荧光底物的培养基上44.5培养24h产生日葡萄糖隆酸酶（glucuronidase），分解荧光底物释放出荧光产物，使培养基在紫外光下产生特征性荧光剖细菌，以此来检测水中大肠埃希氏菌的方法。4. 1. 3 培养基与试剂4. 1. 3. 1 EC-MUG培养基4. 1. 3. 1. 1 成分A膜蛋白陈20. 0 g B乳糖5. 0 g c 3号胆盐或混合胆盐1. 5 g D磷酸氢二御4. 0 g E磷酸二氢饵1. 5 g F氯化锅5. 0 g G 4甲基伞形酣/3-D-葡萄糖醒酸背（MUG)O. 05 g 4. 1. 3. 1. 2 制法GB/T 5750.12-2006 将干燥成
39、分加入水中，充分混匀，加热溶解，在366nm紫外光下检查元自发荧光后分装于试管中，68.95 kPa (115，10 lb）高压灭菌20min，最终pH为6.9土0.2。4. 1. 4仪器4. 1. 4. 1 紫外光灯，6w、波长366nm的紫外灯，用于观测荧光反应。4. 1. 4. 2 培养箱：36l C。4. 1. 4. 3 天平。4. 1. 4. 4 平皿2直径为9cm。4. 1. 4. 5试管。4. 1. 4. 6 分度吸管，1mL,10 mL. 4. 1. 4. 7 锥形瓶。4. 1. 4. 8小倒管。4. 1. 4. 9 金属接种环。4.1.4.10 冰箱：04。4. 1. 5 检
40、验步骤4. 1. 5. 1 接种将总大肠菌群多管发酵法初发酵产酸或产气的管进行大肠埃希氏菌检测。用烧灼灭菌的金属接种环或元菌棉签将上述试管中液体接种到EC-MUG管中。4. 1. 5. 2培养将已接种的ECMUG管在培养箱或恒温水浴中44.5土0.5培养24h士2h。如使用恒温水浴，在接种后30min内进行培养，使水浴的液面超过EC-MUG管的液面。4. 1. 6 结果观察与报告将培养后的EC-MUG管在暗处用波长为366nm功率为6W的紫外光灯照射，如果有蓝色荧光产生则表示水样中含有大肠埃希氏菌。计算ECMUG阳性管数，查对应的最可能数（MPN）表得出大肠埃希氏菌的最可能数，结果以MPN/1
41、00 mL报告。4.2 滤膜法4. 2. 1 范围本标准规定了用滤膜法测定生活饮用水及其水源水中的大肠埃希氏菌。本法适用于生活饮用水及其水源水中大肠埃希氏菌的测定。4.2.2 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。4. 2. 2. 1 大肠埃希氏菌滤膜法membrane filter technique for Escherichia coli 用滤膜法检测水样后，将总大肠菌群阳性的滤膜在含有荧光底物的培养基上培养，能产生严葡萄糖GB/T 5750.12-2006 隆酸酶分解荧光底物释放出荧光产物，使菌落能够在紫外光下产生特征性荧光，以此来检测水中大肠埃希氏菌的方法。4.2.3 培养基与试剂4
42、. 2. 3. 1 MUG青养琼脂培养基（NA-MUG)4. 2. 3. 1. 1 成分A 蛋白陈B 牛肉浸膏C琼脂D 4甲基伞形嗣RD葡萄糖酸酸背（MUG)E蒸饱水4. 2. 3. 1. 2 制法5. 0 g 3. 0 g 15. 0 g 0. 1 g 1 000 mL 将于燥成分加入水中，充分混匀，加热溶解，103.43 kPa (121，15 lb）高压灭菌15min，最终pH为6.8土0.2。在无菌操作条件下倾倒直径50mm平板备用。倾倒好的平板在4条件下可保存两个星期。本培养基也可不加琼脂，制成液体培养基，使用时加2mL 3 mL于灭菌吸收垫上，再将滤膜置于培养垫上培养。4.2.4
43、仪器4. 2. 4. 1 紫外光灯，6w、波长366nm的紫外灯，用于观测荧光反应。4.2.4.2其他仪器同2.2. 4o 4.2.5 检验步骤4. 2. 5. 1 接种将总大肠菌群滤膜法有典型菌落生长的滤膜进行大肠埃希氏菌检测。在无菌操作条件下将滤膜转移到jNA-MUG平板上，细菌截留面朝上，进行培养。4.2.5.2 培养将已接种的NA-MUG平板36土1培养4h04.2.6 结果观察与报告将培养后的NAMUG平板在暗处用波长为366nm功率为6W的紫外光灯照射，如果菌落边缘或菌落背面有蓝色荧光产生则表示水样中含有大肠埃希氏菌。记录有蓝色荧光产生的菌落数并报告，报告格式同总大肠菌群滤膜法格式
44、。4.3 酶底物法4. 3. 1 范围本标准规定了用酶底物法测定生活饮用水及其水源水中的大肠埃希氏菌。本法适用于生活饮用水及其水源水中大肠埃希氏菌的检测。本法可在24h判断水样中是否含有大肠埃希氏菌及含有的大肠埃希氏菌的最可能数（MPN）值。本法可同时检测总大肠菌群，方法见2.3。4.3.2 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。4. 3 2. 1 大肠埃希氏菌酶底物法enzyme substrate technique for Escherichia coli 在选择性培养基上能产生自一半乳糖昔酶P0-galactosidase）分解色原底物释放出色原体使培养基呈现颜色变化，并能产生日葡萄糖
45、醒酸酶Pglucuronidase）分解荧光底物释放出荧光产物，使菌落能够在紫外光下产生特征性荧光；以此技术来检测大肠埃希氏菌的方法为大肠埃希氏菌酶底物法。18 4.3.3 培养基与试剂培养基与试剂同2.3.30 4.3.4 仪器设备4. 3. 4. 1 紫外光灯：6w、波长366nm的紫外灯，用于观测荧光反应。4.3.4.2 其他仪器同2.3.404.3.5 检验步骤检验步骤同2.3. 5 0 4.3.6 结果观察与报告4. 3. 6. 1 结果判读GB/T 5750. 12-2006 结果判读同2.3. 6. 1，对照表同表4与表5。水样变黄色同时有蓝色荧光判断为大肠埃希氏菌阳性，水样未变
46、黄色而有荧光产生不判定为大肠埃希氏菌阳性。4.3.6.2 定性反应将经过24h培养颜色变成黄色的水样在暗处用波长为366nm的紫外光灯照射，如果有蓝色荧光产生判断为阳性反应，表示水中含有大肠埃希氏菌。水样未产生蓝色荧光判断为阴性反应。结果以大肠埃希氏菌检出或未检出报告。4. 3. 6. 3 10管法4. 3. 6. 3. 1 将培养24h颜色变成黄色的水样的试管在暗处用波长为366nm的紫外光灯照射，如果有蓝色荧光产生则表示有大肠埃希氏菌存在。4.3.6.3.2 计算有荧光反应的试管数，对照表4查出其代表的大肠埃希氏菌最可能数。结果以MPN/100 mL表示。如所有管未产生荧光，则可报告为大肠
47、埃希氏菌未检出。4.3.6.4 51孔定量盘法4. 3. 6. 4. 1 将培养24h颜色变成黄色的水样的定量盘在暗处用波长为366nm的紫外光灯照射，如果有蓝色的荧光产生则表示该定量盘孔穴中含有大炀埃希氏菌。4.3.6.4.2 计算有荧光反应的孔穴数，对照表5查出其代表的大肠埃希氏菌最可能数。结果以MPN/100 mL表示。如所有孔未产生荧光，则可报告为大肠埃希氏菌未检出。5 贾第鞭毛虫5. 1 免疲磁分离荧光抗体法5. 1. 1 范围本标准规定了用免疫磁分离荧光抗体法测定生活饮用水及其水源水中的贾第鞭毛虫抱囊和隐抱子虫卵囊。本法适用于生活饮用水及水源水中贾第鞭毛虫抱囊和隐于包子虫卵囊的测定。5. 1. 2 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。5. 1. 2. 1 贾第鞭毛虫giardia 种可能在水中或其他介质中发现的原虫类寄生虫。有两个种，它们的宿主是：G. intestinal is （人类）和G.
