1、ICS 67.060 B 22 中华人民共和国国家标准GB/T 7416-2008 代替GB/T7416- 2000 麦大酒啤Malting barley 2009-06-01实施2008-06-25发布发布中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会GB/T 7416-2008 自次前吉.ml 革围2 规范住引用文件3 术语和定义4 产品分类.2 5 要求.2 5 分析方法.37 检验规划8 标志、包装、运输和贮存.8 附录A(资料性附录)企业自控技术指标的分斩方法. 9 Z GB/T 7416-2008 JjIJ 本标准代替G丑IT74162000(啤酒大麦。本都准与GB
2、/T7416一2000相比主要变化如下:术语幸在定义中，增加了啤黯大麦的定义，去掉了水敏感性的撞述，对二棱、多棱大麦等其他定义描述作了适当修改;一一将表1中项目感宫改为外观，其描述未作修改;一一一将原表2拆分为两个表格，二棱、多棱大麦理化指标分别列入两个表中5工棱、多棱大麦优级和一级的千载重撞标各提高了1个百分点，二级不变;一对工棱、多棱大麦的蛋白皮指标分别作了演整;叫一将她粒试验改为饱满粒和瘦小粒，二棱、多棱大麦优援和一级的健满粒指标各提高了3个4个百分点，二级不变，增加了瘦小粒的要求z一取消了水敏感性指标，但将其测定方法放入前录A中;一叫溺定王天、五天发芽率的两个方法，将平盟法作为第一法，
3、漏斗法改为第二法;一叫判定规期中，主要指标除五天发芽率外，另增起了水分指标;一一将生产企业需要自行控制的一些指标的分析方法，作为附录A列出，供企业参考;一一将原南录A、附录B合并。本都准的附录A为资料性附录。本标准自全国食品工业标准化技术委员会醒酒分技术委员会提出并归口。本标准起草单位z中国食品发酵工业研究院、永膜泰麦芽集团有限公司、广州珠江啤酒殷份有限公司、广到麦芽再限公词、北京强京啤酒股份有黑公司、宁波麦芽有眼公司。本标准主要起草人z张五九、康本璜、熊晓帆、方贵权、莫力、贺凤超、张海波、李惠萍、林艳、黄释燕、韩永红、古方红、柴凤萍。本标准所代替标准的历次殷本发布情况为:一一GB741619
4、87 .GBI丁741620000皿G/T 7416-2008 啤酒大麦1 范围本标准规定了啤酒大麦的术语和定义、产品分类、要求、分析方法、检验规则、标志、包费、运输和贮存。本标准适用于晦酒酿造专用大麦的收购、检验与销售。2 巍茹性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注目期的引用文件，其题后所有的修改单(不包括勘误的内容或修订摄均不适用于本标准，然币，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新服本。凡是不注自期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 191 包装储运圈示标志GB/丁601化学试剂标准滴定搭载的制备GB/丁603化学试荆试黯方法中所
5、用靠自荆及市j品的制备(GB/丁603-2002，IS06353叩1:1982，NEQ) GB 2715 稳食卫生标准GB/T 54引粮食、油料检拴抨样、分样法GB/T 6682 分新实验室用水规格和试验方法(GB/T6682-1992 , neq IS0 3696: 1987) 3 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3. 1 啤酒大麦malting barley 经过一定程序认定的，适用于割麦和啤酒酿造的工棱大麦及多棱大麦。3.2 工幢大麦2-row barley 一棱大麦的麦穗呈崩彭，沿穗轴只有对称的两行籽粒3.3 多模大麦multi-row barley 四棱和大棱大麦统称为多棱大麦
6、。3.3. 1 E棱大裴牛row恼rley四棱大麦有两对籽拉互为交错，麦穗断而呈四角形。3.3.2 3.4 六棱大麦6-row barley 六棱大麦有六行麦救国烧一根穗轴雨生，麦穗毒rr丽呈六角形。千粒童tbousand kernels weigbt 1 000颗麦粒的绝于虔堂。1 GB/T 7416-2008 3.5 三天发芽署在于daygermination rate 三天后大麦发芽粒占总麦粒的百分数，主要表示的整齐程度。3.6 五天发芽率萨拉aygermination rate 五天后大麦发芽粒占总麦粒的百分数，主要表示可发芽的大麦百分数。4 产品分类按麦穗形在分为z二楼大麦和多棱大麦
7、捧回棱大麦程六棱大麦。按播种季节分为:春大麦和冬大麦。5 要求5. 1 感官要求感官要求应符合表1的规定。外窥气味位级被黄色具有先泽，无痞斑粒a固有的香气，元璋味和其他异味a此处指检疫对象所规定的病斑粒。5.2 理化要求5.2.1 二楼大爱工棱大麦班符合表2的巍定。襄1感官要求级换黄色或黄色，稍有光泽，无病斑粒a无摇味和其他弄味裴2二楼大麦理化要求级，先病斑粒a无穗味和其能异味二援大爱项自优级一摄一级一夹杂物/%三1. 0 1. 5 2.0 破损事/%运二0.5 1. 0 1. 5 *分/% 12.0 13.0 千粒麓班干基计)/g飞:;.- 38.0 35.0 32.0 主荣发辛辛二三95
8、92 85 主圣辈革飞 97 95 90 蛋白股白干基计)/%10.0.12.5 9.013.5 饱满粒(腹径注2.5mm)/% 飞:;.- 85.0 80.0 70.0 蝶小牧腹径2.2mm)/% 4.0 5.0 6.0 5.2.2 多棱大麦多棱大麦应符合表3的规定。2 G/T 7416-2008 表3多棱大麦理化要求项自多棱大麦侥级级一极一夹杂物/% 1. 0 1. 5 2.0 破损碍这/% 0.5 1. 0 1. 5 本分/% 12.0 13.0 千粒重棋子基计)/g，飞F 37.0 33.0 28.0 三天发芽旦在/% 95 92 85 五天发芽率/%三去97 95 90 j蛋白质(以
9、调计)/到10.0-12. 5 9.0-13. 5 饱潜毅攘役二三2.5mm)/% 飞:;:;- 80.0 75.0 60.0 瘦小校腹径2.2mm)/% 4.0 6.0 8.0 5.3 卫生要求参照GB2715和相关标准执行。 分辑方法本方法中房用的水，在没有注明其他要求时，应符合GB/丁6682的要求。所用试刻，在未注明其他规格时，均指分析纯(AR)0配制的溶滚，除另有说明外，均指点溶液。向一稳撰i项目，有两个或两个以上分析方法时，实验室可根据各自条件选用，但以第一法为仲裁法。理化分析除夹杂物、破损率外所用的大麦样品一律采用除杂均匀的试样。6. 1 外现在自然光线明亮的场所哀察大麦的颜色，
10、将大麦样品在手中握5min，并嗅其气味善现着颜色;记录有无光泽、病斑粒栓疫对象所规定的、霉变粒、霉味或其铠异味等情况。6.2 夹杂物称取样品200在精确至O.1 g)，拣出其他植物种子、桔轩、士石等非大麦物质及款支、病斑粒非检疫对象所规定的)，在天平(感量0.1g)上称其股量，计算其所占的百分数。所得结果表示至一位小数a6.3 破损率称取样品200g(精确至0.1g)，拣出破毅、半粒，在天孚感量O.1 g)上称其质量，计算其所占的百分数。所得结果表示至一位小数。6.4 水分6.4.1 原理样品于105C -107 oc直接干燥，所失质量的百分数即为该样品的水分6.4.2 仪器6.4.2.1 分
11、析天平=感蟹。.1mgo 6.4.2.2 电热干燥箱:控温精皮士1C。6.4.2.3 称量血:30mmX50 mmo 6.4.2. 4 Miag DLFU盘式粉碎机或麓风靡。6.4.2.5 干燥器:用变色砖段作干燥剂。3 GB月7416-20086.4.3 分新步囊6.3. 1 缰粉试样韵串i备取一定量大麦试样，使用MiagDLFU盘式粉碎机，盘问距为0.2mm，进行粉碎脂，即得别细粉试祥。6.4.3.2 翻定称取结粉试样3g-5 g(精确106 oc士1oc电热干燥箱内，再放入电热干燥箱内烘1h , 6.4.4 结果计算O. 000 1 g)，置于己娱至恒重的称最血中，连同盖一并放人，娱3h
12、o趁热盖上盖子移入干燥器内冷却，30min后称盘，然后试样的水分按式。计算，数值以%表示。式中zX1一一试样水分的政最分数，%; X1 ml-m X 100 ml一zml一一干:操前称量皿细试样的质蠢，单位为克(g);m2一一干蝶后称量血如试样的质量，单位为克(g); m一一称量嚣的揉囊，单位为克与。所得结果表示至一位小数。6.4.5 精密度在重复性条件下蔽碍的两次独立黯定结果的绝对差遣不得越过算术孚均值的2%。6.5 千粒重6.5. 1 仪器6.5. 1. 1 计数器。6.5. 1. 2 天平:!磁盘0.1go 6.5.2 分相步搬( 1 ) 从拣出异物的大麦样品中直接随机数出1000粒大麦
13、颗粒，在天平上称其质量。至少做两次平行试验。6.5.3 黯果计算试样的干粒蓝按式(2)计算，数盖以克表示。X2 = X2, (1 X1) 式中zXz一试样的千粒重跃于基计)，单位为克(g); X2，直接称最得到的试样风干千粒重，单位为克(g);X1一试样水分的最最分数，%。所得结果表示至一位小数。6.5.4 精密度在重复性条件下挺得的两次独立测定结果的绝对提债不梅超过算术平均值的2%。6.6 二天、丑天发芽率6.6.1 培弊皿法6.6. 1. 1 仪器6. 6. 1. 1. 1 培养皿t直径10cm。在6.1. 1. 2 恒温恒温培养箱。在在1.1.主法纸:中速器纸。4 .( 2 ) G/T
14、7416-2008 6.6. 1. 2 分斩步黯将两张直径9cm的中速滤纸放入培养皿底部，主114mL水均匀渴望法载。取100粒试样放在油纸上，使每一麦粒的援部很好地与滤挺接触，盖上培养蓝蓝，用薄膜封口以防止水蒸发，或将培养盟放人恒温捏温培拌箱中。在温度18oC -.20 c下，于暗处静置发芽。6.6. 1. 3 结果计算放量72h眉大褒发芽粒数为三天发芽率按式(3)计算，数值在%表示。X 3 = 100n剿.( 3 ) 放置120h后大麦发芽粒数为五天发芽率按式份计算，数值以%表示式中:儿一-试样三天发芽率，%; n不发芽麦粒数zX4一一试样五天发芽率，%。所得结果表示至整数。6.在1.4精
15、密度X 4 100 - n ( 4 ) 在重复性条件下获得的两次独立拥定结果的绝对差蕴不得超过算术平均值的3%。6.6.2 嚣斗法6.6.2.1 位黯6.6.2. 1. 1 漏斗z直径100mm，在颈中有一扁平的小瑛棒。在6.2.1. 2 培养盟盖。6.在2.1.3大烧杯。6.6.2. 1. 4 喷雾器。6.6.2.2 分斩步骤取1000粒试样放在大娃杯内，用18c -. 20 oC水浸渍1ho弃水，用自来水洗5次，再用18oC ,., 200C水浸渍豆。弃水，转移麦粒到漏斗中，盖上培养血盖，在18c ,., 20 c下静置过夜。次日将麦粒倒出，混匀，用喷雾器喷水，使麦粒潮涯，再装回漏斗中。此
16、操作于上下午各进行一次两次操作间隔时间为10h-12怡。6.6.2.3 结果计算搜撞开始后72h大麦发芽粒数为二天发芽率按式(5)计算，数值以%表示。1 000 - n 3= ( 5 ) 1号浸溃开始后120h大麦发芽粒数为五天发芽率按式(6)计算，数值i互1 000 X4口4hn .( 6 ) 式中zX3 试样三天发芽率，%;n-一一不发芽麦粒数;X4试样五天发芽率，%蹲班得结果表示至整数。6.6.2.4 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对盖债不得越过算术平均值的2%。6.7 蛋白鼓6.7. 1 底埋在催化剂作用下，用硫酸分解样品，使有机化合辑中的氮转变成氧，以确酸溶液吸收蒸铺
17、出的氨，用GB/T 7416-2008 酸碱滴定法测定氮含量。6.7.2 试剂和溶液6.7.2.1 不含氨的水:按GB/T603配制。6.7.2.2 浓硫酸:95%，_98%。6.7.2.3 氢氧化铀溶液(400g/L):称取400g氢氧化锅溶于1L不含氨的水中，静置。吸取上层清液于带橡皮塞的瓶中。6.7.2.4 棚酸溶液(20g/L) :称取20g棚酸，用水溶解，并定容至1L。6.7.2.5 盐酸标准滴定溶液c(HCl)=0.1 mol/LJ:按GB/T601配制与标定。6.7.2.6 混合催化剂:将硫酸饵(K2S04)、硫酸铜(CUS04 5H20)按10+1的比例混合，并研细。6.7.2
18、.7 澳甲盼绿指示液(1g/L) :按GB/T603配制。6.7.2.8 甲基红指示液(1g/L):按GB/T603配制。6.7.2.9 澳甲盼绿混合指示液z按10+4的比例分别吸取澳甲盼绿乙醇溶液和甲基红乙醇溶液，并混匀。6.7.3 仪器6.7.3.1 凯氏定氮仪:自行组装的仪器或成套仪器。6.7.3.2 天平:感量0.1mg。6.7.3.3 酸式滴定管:50mL。6.7.4 分析步骤成套仪器按使用说明书进行试样测定。自行组装的仪器按下述方法进行操作。6.7.4. 1 细粉试样的制备同6.4.3. 10 6.7.4.2 试样消化称取细粉试样1.5 g(精确至o.000 2 g)，小心转移到己
19、干燥的凯氏烧瓶中，加入混合催化剂10g , 缓缓加入浓硫酸20mL，摇匀，在通风橱内文火加热至泡沫停止发生后，大火使之沸腾。待溶液清亮后，再继续加热20min,_ 30 mino 6.7.4.3 试样蒸锢待消化液冷却后，缓缓加入不含氨的水250mL，摇匀，冷却，并加入几块小瓷片。连接凯氏烧瓶与蒸馆装置，将馆出管的尖端插入己盛有25mL棚酸溶液和0.5mL澳甲盼绿混合指示液的锥形瓶中，馆出管尖端应在液面之下。通过加液漏斗加入70mL氢氧化铀溶液于凯氏烧瓶中，轻轻摇匀，使内容物混匀，然后加热蒸馅。待馆出液达到180mL时，停止蒸馆。6.7.4.4 试样滴定用盐酸标准滴定溶液滴定馆出液，颜色由绿色消
20、失转变为灰色即为终点。记录消耗盐酸标准滴定溶液的毫升数。按上述操作同时进行空白试验。6.7.5 结果计算6 试样的蛋白质按式(7)计算，数值以%表示。X = iV2 - V1 ) x c X 14 5二hJ、咱:，:x 6. 25 X 100 ( 7 ) 式中:Xs一试样蛋白质含量的质量分数(以干基计)，%;V2一一试样滴定时消耗盐酸标准滴定溶液的体积，单位为毫升(mL);V1一一空白滴定时消耗盐酸标准滴定溶液的体积，单位为毫升(mL);c 盐酸标准滴定溶液的浓度，单位为摩尔每升(mol/L); GBjT 7416-2008 14一一氮的摩尔质攘的数值，单位为克每摩尔(g/mo)M(N) =
21、14J; m-一一称取试样的质嚣，单位为克(g);Xl-一试样水分的质最分数，%;6.25氮与蛋白皮的换算系数。所得结果表示至一位小数。在7.6精密度在重复性条件下获得的两次数立榄定结果的绝对毅值不得越过算术平均值的4%6.8 饱满粒、要小较6.8.1 原理大麦样品在一个具有不同孔径的王层第板的振动中，按将粒大小姐以第分。6.8.2 仪器6.8.2.1 天平z感量。.1g。6.8.2.2 选粒在L:岳电动就通过曲轴带动，装有3层第援，上下间距为12mm,., 25 mm，并有盘子和底盘。全挠，单高度80mm,._ 100 mm 选粒机应符合以下要求:筛极材料:由厚度为1.3mm士0.1mm的硬
22、黄铜制成，上有条状孔，加工公差为0.03mm 筛板尺寸:长为43cm，宽为15cm 筛孔尺寸:上面为长度25mm，下面为长度22mm。宽度，第1为2.8mm，第E为2.5mm，第里为2.2 mm 筛孔数曰:第I为28X13，第直为30X13，第自为32X13。振荡速度:300r/min,._ 320 r/mino 合移动的总长度:18 mm,., 22 mm 筛面应在四个方向严格保持水平，孔径应经常用双脚规核对。6.8.3 分析步黯称取试样100g(精确至0.1g)，放入选粒机上层，加盖，开启电动机，准确提荡5mino将2.5mm 以上的麦粒进行称壁，以百分数表示。所得结果表示至一位小数。7
23、撞撞规剧7. 1 组提同一产媳、向一品种、同一软获期、同等级、问货位、同车船舱的产品为一批。7.2 抽样醺7.2.1 按表4抽取样本数。我4蛐样表批最/袋抽珉样本数/袋合格典i定数(Ac)不舍楼如i定数(Re)26150 5 1 2 151500 8 1 2 5013 200 13 2 3 3 20135 000 20 3 4 注1:.样本系指产品的般大租棋。注2:散装大麦按GB/T5491抽样，每次抽取的样品数不得少于5问。7 GB/T 7416-2008 7.2.2 按表4插取样本后，再丛每今样本中抽取5号。g样品，将所有抽琅的样品混匀，用对角四分法分为两份，一扮封存备查，另一箭做感宫和理
24、化分析。7.3 交收捡瑜7.3.1 交收时出相应质栓部门负责按本标准规定逐批进衍检验。7.3.2 交枝检验项目包括z净含量、感官要求、夹杂物、破损率、水分、千粒重、三天发芽率、五天发芽率、蛋白捷、饱满粒、瘦小糙。7.4 判定规则7.4.1 按表4抽政样本，先进行包装和净含量的检查。若检验结果达到不合格判定数者，则判整批产品为不合格。7.4.2 理化指标中的水分和五天发芽率为政最等级的主要指标，当其他指标都在同一级别时，而水分或五天发芽率指标有一项不在这一级别，则以该项指标所在级别为准。7.4.3 理化指标中，所有其他指标都在同一级别，只有一项指标踪水分和五天发芽率外低于该级射时，不作跨级处理。
25、.该项指标低于下一级到时，则降至下一级别。7.4.4 理化摇标中，所有其他指标都在同一级别，但再两项指标除水分和五天发芽率外能于该级别时，降至下一级剔。8 标志、包装、运输和世存8. 1 标志8. 1. 1 啤酒大麦运到粮库或规定地点，应标明产蝇、品种名称、收获时间、收购吕期、类娟、等级。8. 1. 2 销售的产品应具有质量合格证，并标明生产广名、广址、产品名林及品种、批号、净重、执行标准代号。8.1.3 锯运团京的标志应符合GB/T191的有关规定。8.2 包装在2.1 元论采用何种包装形式，不同品种、不同产地不得混杂人库。在2.2啤酒大麦可以散装，放入筒仓或粮垛。8.2.3 啤酒大麦也可以
26、用麻袋或编织翁包装人库。8.3 运输啤酒大麦运输时，车厢或其他运输工具应保持清洁、干燥，元外来气味和市染物。8.4 贮存8.4. 1 保管大麦要做到先进先出，避免保管不妥，造成损失。8.4.2 仓库摆保持清洁、子燥、通风。要定期进行拴查，要防潮湿、穗变、鼠虫害等。如发现问题，应及时处理。8.4.3 每盘大麦要标明产地、品种、数量、等级、收购百期。8 GB/T 7416-2008 附录A资料性酣录企业自控技术指标的分斩方法A.1 大麦中霉菌数的翻定A. 1. 1 京理通过无菌水的冲洗，将大麦表腥的微生物冲于水中，然后在培养基上墙舜，根据酣落数判断大麦表醋的霉菌污染程度。A. 1.2 试剂租藩灌孟
27、加拉红培养基(31.6 g/L) :称取31.6 g孟加拉红培养基，加入1000 mL水槽化，分装，于121oc 20 min高压灭菌备用。A. 1.3 仪器A. 1. 3. 1 摇床:转速180r/min.200 r/min。A. 1. 3. 2 三角瓶:300mLo A. 1. 3. 3 培养血:直径10cmo A. 1. 3. 4 移液管:0.2mL。A. 1.4 分新步黯A. 1. 4. 1 称取麦粒试样10g(精确至0.02g)制人盛有90mL元菌水的三角瓶中，癖紧棉赛，置于摇床，扭扭C，转速180r/min.200 r/min下，振荡30mino A. 1. 4. 2 将孟加拉红培
28、养基融化，在无商条件下倒平陋，冷却为固体后备用。A. 1. 4. 3 在主菌条件下，用已灭菌的移液管吸取A.1. 4. 1液0.2mL涂于平皿上得个试样平行做3个平阻)，将平皿倒置，于25oc培养7夭。A. 1. 4. 4 数平m的菌落数。A.2 大麦晶种的鉴定A. 2.1 黯跤电旗法A.2. 1. 1 原理通过藏丙烯蘸黯凝跤电法(PAGE)鉴定大麦品种，用板式凝肢电掠分离大麦的醇溶蛋白部分。A.2. 1. 2 试娟和港法A.2. 1. 2. 1 萃东滚z称取18g尿素和0.01g申，用水溶解，然后加人2-硫氨基乙醇1mL和氯乙醇20mL，碍用水定容至100mLo A. 2. 1. 2. 2
29、硫酸亚铁溶液(5g/L):按GB/丁603配制。A. 2. 1. 2. 3 凝胶贮备液:称取115.3 g丙烯瞅胶、4.6g亚申叉双丙烯酷康、69.2g尿素、1.2g甘氨酸、1.2g抗坏血酸，用水溶解，加人3mL硫酸亚铁溶液(新配制的、23mL冰乙酸，混匀，1 L。抽泼、脂被人棕色瓶中，于4oc下贮存，当月使用。A.2. 1. 2. 4 过氧化氧溶攘z吸琅30%过氧化氢2mL，用水定容至100mLo A.2. 1. 2.5 电极援冲溶液z称取2g甘氨酸，用水搭籍，加入20mL冰乙酸，再加7(至5Lo A.2. 1. 2. 6 王氯乙酸搭液(10g/L):称取10g二氧乙酸，用水溶解，并定容至1
30、00mLo A.2. 1. 2. 7 考玛斯亮蓝搭波(10g/L):称取1g考马斯亮蓝，用95%乙醇搭解，并定容至100mLo A.2. 1. 2. 8 染色攘攘z吸取20mL三氧乙酸溶液，加入1mL考马斯蓝溶液，混合备用。9 GB/T 7416-2008 A. 2. 1. 3 仪器A. 2. 1. 3. 1 垂直板式凝胶电泳仪。A. 2. 1. 3. 2 分析天平:感量0.1mg o A. 2. 1. 3. 3 离心机:转速5000 r/min，离心管9mmX35 mm; A. 2. 1. 4 分析步骤A. 2. 1. 4. 1 样品数:取100粒大麦用于本测定。A.2. 1. 4. 2 萃
31、取大麦醇溶蛋白:单独碾碎每粒大麦并放入离心管中，吸取0.4mL萃取液混合，浸泡最少16h，使用前将离心管置于离心机中，在转速5000 r /min下，离心30min。A. 2. 1. 4. 3 凝胶的形成:于100mL凝胶贮备液中加入0.15mL过氧化氢溶液，混匀。将已充分混匀的溶液灌入灌胶模具中(要保证凝胶有1.5 mm厚度，10cm,._. 15 cm长度)，在几分钟内聚合即会发生。用一把梳子在凝胶内开槽，以便放置样品(梳子一定要在刚刚灌胶时放入)。A. 2. 1. 4. 4 凝胶展层:撤掉梳子，吸取适量的萃取液10L，._.20L加入凝胶顶部的槽内(若条带分离不清，则取量可减少)，将每一
32、槽装上样品，把凝胶玻板垂直地放入缓冲溶液中，使槽在板的上侧，让自来水循环流过电泳仪的冷却装置，使溶液冷却并保持在10oC ,._. 20 oC。在200V下凝胶展层20min，然后在500V下继续展层，时间为色带(甲基绿)通过凝胶所需要时间的两倍。A.2. 1. 4. 5 凝胶展层后，将凝胶从玻璃板上取下，立即在染色液中染色，凝胶可持续染色一夜。A. 2. 1. 4. 6 照相:凝胶染色后在蒸馆水中浸泡1h脱色，然后取出放在灯箱上照相，胶板与镜头约400 mm。A.2. 1. 4. 7 结果的显示:根据与用纯品种所得结果进行比较后，可对大麦样品中的各种品种做定性的阐明，为定出各种品种的量，要用
33、存在于样品中的每一品种已确认的谷粒数除以谷粒的总数(100)。若做平行试验，则需用平均值表示(用百分数)，并四舍五入至整数。A.2.2 聚合酶链式反应法A. 2. 2.1 原理通过聚合酶链式反应(PCR)扩增技术，对大麦DNA进行体外酶促扩增。经聚丙烯酷胶凝胶电泳分离扩增产物后，与原大麦纯品种基因图谱进行对照鉴定待测大麦样品。A.2.2.2 试剂和溶液A. 2. 2. 2. 1 Tris-盐酸溶液(1mol/L , pH=8. 0):称取121.1 g三瓷甲基氨基甲炕(Tris)，用800mL 去离子水溶解，冷却至室温后用浓盐酸调节溶液的pH值至8.0(约需42mL浓盐酸)，加水定容至1L ,
34、 分装后高压灭菌。A. 2.2.2.2 EDTA溶液(0.5 mol/L , pH二8.0):称取186.1 g乙二胶四乙酸二销(EDTA，CloH14N20sNa2 2H20)，加入800mL水中，在磁力搅拌器上搅拌，用氢氧化纳调节溶液的pH值至8.0(约需20g NaOH颗粒)然后定容至1L，分装后高压灭菌。A. 2. 2. 2. 3 DN A提取液:称取46.75 g氯化销和20g澳代十六烧基三甲胶(CTAB)，加入800mL去离子水，摇动容器使溶质完全溶解。然后加入50mL Tris-盐酸溶液(A.2. 2. 2. 2)和20mLEDTA溶液(A. 2. 2. 2. 2) ，用水定容至
35、1L，分装后高压灭菌。A. 2. 2. 2. 4 三氯甲炕-异戊醇溶液(24+1):量取240mL三氯甲烧和10mL异戊醇混匀。A.2.2.2.5 核糖核酸酶A(RNaseA，10mg/mL):生化试剂公司购买。A. 2. 2. 2. 6 PCR扩增试剂:生化试剂公司购买PCR扩增试剂包括:TaqDNA聚合酶、dNTP、氯化镜(MgClz)、PCR缓冲液(含MgClz)、引物(Primer)。A.2.2.2.7 电泳缓冲液1(10XTBE):称取108g Tris碱、55g棚酸和7.44g EDTA混合，用重蒸水溶解后，在定容至1Lo A.2.2.2.8 电泳缓冲液ll(50XTAE):称取2
36、42g Tris碱和37.2g EDTA混合，加入57.1mL冰醋酸，用重蒸水溶解后，定容至1L。10 GB/T 7416-2008 A. 2. 2. 2. 9 丁E缓冲液:在800mL水中依次加入10mL Tris叩盐酸滚滚(A.2. 2. 2.1).2 mL EDTA溶液(A.2. 2. 2.幻，加水定容至1L，分装后高压灭菌。A.2.2.2.10 兀菌水z取重蒸水100mL., 200 mL，在121c天菌20mino A. 2. 2. 2. 11 变性上样缓冲被z称取10g票糖、20mg漠醋兰、20mg工申苯青，潜于90mL去离子甲黠按中，用慧蒸水定容至100mLo A.2.2.2.1
37、2 韶定液(10%):量取100mL泳醋酸，加入900mL盘旗水，混匀。A.2.2.2.13 疏代硫酸锅滚滚(10%):称取10g疏代硫酸锅，加人100mL重蒸水溶解。A. 2. 2. 2.14 凝胶被只):称取60g丙烯鼓鼓、3.1 g亚甲叉双丙烯眈胶、420g尿素和吸取50mL电掠接冲液1(人2.2.2.7)混合，用重蒸水溶解后，在定容至1Lo A. 2. 2. 2.15 凝胶染色液z称取1g硝酸银，加入1000 mL慧燕水，再加入1.5 mL申踵，混匀。A. 2.2.2.16 凝胶显影液:称取30g元水碳酸纳，加入1000 mL敢燕水溶解后，再加入0.2mL疏代硫酸纳(A.2.2.2.
38、13)和1.5 mL甲醒，混匀。A. 2. 2.2. 17 琼脂糖凝胶(0.8%):称取0.8g琼脂糖加入100mL 1XTAE电泳援?中滚重后，如热溶解。A.2.2.2.18 乙醇(70%):吸取700mL无水乙醇，加水定容至1Lo A.2.2.3 仪器A. 2. 2. 3. 1 PCR仪z温度梯度变化反应灵敏准确。A.2.2.3.2 被压电泳仪z电压10V3 000 V、电注2mA,._ 200 mA、功事5W.，20台WoA.2.2.3.3 离斗机:是温可达4C以r、转速10000 r/mino A.2.2.3.4 缸室主水豁z控温精度士0.1oc。A.2. 2. 3.5 微最移液器z精
39、确到0.1mLo A. 2.2.3.6 凝段成像仪:可连接电踊拍照。A.2.2.3.7 电掠槽2垂直电涂捕和*平电站槽。A. 2.2.3.8 回旋水平脱色摇床z转速1000 r/min- 10 000 r/mino A. 2. 2. 3. 9 X光灯。A. 2. 2. 3. 10 玻璃板。A. 2.2.3. 11 离心管:1mL., 2 mLo A. 2. 2. 3.12 PCR薄撒智。A.2.2.3.13 分析天平:感最0.1mgo A.2.2.4 分析步骤A. 2. 2. 4. 1 DNA的提取(CTAB法a) 取适量大麦新鲜叶片在研钵中放人液氮后研磨，使其成结着状。操作过程中小心冻伤。b
40、) 取0.5g左右的大麦叶片组织鼓入一支2mL灭菌寓心管中，加入800L_._，900LDNA提取法(A.2. 2.2.白，轻轻颠费It莲匀后，在650C惺温水浴中保温40min-l h，中间每隔10min颠笛一次。从水浴中取出在冰上放宽5min，f1U人等体积的三氯甲:境-异戊醇溶液(A.2. 2. 2.的，颠倒混匀先馒后快)10 min，在低温(40C)下，8000 r/min-10 000 r/min离心10mino d) 取上清液移入另一支2mL灭酶离心管中，加入3LRNaseA，置于370C恒温水浴30min(去除DNA中的RNA)。e) 在37c保温盾加等体积的1氯甲:惋m异戊醇溶
41、液(A.2. 2. 2. 4) ，颠倒混匀(先慢后快)10 min, 在低温(40C)下，8000 r/min-10 000 r/min离心10mino 。取上清液移入另一支2mL离心管中，加入2倍体积的无水乙醇匀，室温下静止约3min 20 c冷冻)，主要翻混11 GB/T 7416-2008 g) 用灭菌枪头挑出DNA.，并用70%乙醇漂洗2，_.3次，室温下放置干燥，乙醇挥发后加入100L1XT立或者无阁水溶解。h) 用琼黯穗凝肢(A.2. 2. 2. 17)栓测(约需2L，_.3L)，电泳后放凝跤于凝胶成豫仅拍照样品于-200C保存备用。A.2.2.4.2 PCR扩增在PCR薄壁管中用
42、微量移液器依次加入12.8L元菌水、2LPCR援冲液、2L200mol/L dNTP、2L500 p.mol/L引物、0.2L1 U/p.L Taq DNA聚合酶，最后加入1L大麦DNA(浓度30 ng/ p.L,._, 50吨/L)便终体积达20L，加5L矿辑油离心10s，混匀放人PCR仪扩增。大麦模板先在940C贺变性5min后，按下列条件进行扩增锚环35个轮次:(1)例变性30S; (2) 55 oC退火40S; (3) 72 oC延律40s。最后在720C下保温10min结束扩增，取出扩增产物放置于4oC冻箱备用。A.2.2.4.3 骤丙烯黠胶挺段板的制作a) 首先用自来水将玻璃平提崭
43、耳朵板冲洗干净。b) 区分好两块玻璃援正反面后用乙醇分到擦拭遍。c) 待乙醇挥发后在平板一面用亲和硅:境均匀涂抹两次，耳朵板用剥离硅:境均匀涂抹商次此操作在逼反黯下操作，小非被腐惶。d) 上述步暖完成后，将两片压条分期放于平板(涂亲和硅荒一面)两侧，并将耳朵板(涂剥离硅;读一面援于平板上面，用夹子加紧。e) 将凝跤贮存液(A.2. 2. 2. 14)沿两板之间的缝隙(耳朵摄一钝缓慢灌入，灌跤过程中勿使气混，避免对实验产生影响(60mL凝胶贮存液十200L10%过疏酸按十100LTEMED)0 f) 胶灌好以后，将梳子不带茜子一端)插入肢面，插人深度要适宜。g) 室温放置1h，._，2坠静止凝胶
44、掖摇温度确定凝胶时间。A. 2. 2. 4. 4 预电泳a) 胶凝吕定好以后将模子拔出，平板一面向井，耳朵板一面向内放于茸直电泳槽内，两端用铁夹子加紧。b) 将电泳援冲液1(A. 2. 2. 2. 7)稀释为0.5XTBE，溶于垂直电这撞上下槽肉，吹净鼓板上样端的碎段。c) 将电法槽的电源钱连接电泳仅后，通电。70W程功率电泳30mino A.2.2.4.5 上样跑电泳a) 30 min预电泳后黯屯，将梳子有齿一端插入肢板内，适宜深度。如将PCR扩增产物加入变性主样缓冲液后，在PCR仪内94c变住5min，并迅速转移至冰水内冷却。c) 取3L，._，5L变性扩增产物膜挠子孔加人，且动电摄，70
45、W怪功事电泳45mino A. 2. 2. 4. 6 银染显影12 a) 电泳后将玻璃扳分开，把平板粘有凝胶的玻璃板放人装有固定被(A.2. 2. 2. 12)的洗肆盒内，在西族水平摇床上振荡20min,._, 30 min，国定脱色。b) 脱色后用重蒸水东洗2次.-.3次，3min/次5min/次。c) 用凝胶染色攘九2.2.2. 15)染色20min 30 min。d) 迅速用重蒸水水洗8s ., 10 So e) 用凝鼓显影液(A.2. 2. 2. 16)显影，直到可见清晰带为止。打用10%冰醋酸周定3min.-.5 mino g) 用重蒸水水洗3min,._, 5 min，室温下风干。
46、GB/T 7416-2008 A.2.2.4.7 结果的显示将风干后的玻璃板敖在X光灯箱上，与己知大麦品种的原纯品种基因图谱进行xw.捕比枝，详细记块。A.3 水敏感性测定A. 3.1 原理取两组试样，分别加入4mL和8mL水，保温发芽，南辑发芽麦粒的百分数之差，即为Jj(敏感性。A.3.2 仪器A.3.2.1 培养血z直径10cmo A.3.2.2 刻度吸管z分皮值。.1mLo A.3.3 分耕步罪取两组培养盟，分别将两张9cm的滤纸敖入培养盟底部，再分别加入4.0mL租8.0mL水均匀润湿滤纸。各取100粒大麦试样放在滤纸上，使每一麦粒的腰部很好地与滤或接触，盖上盟盖。将培养血放入塑料袋密
47、闭，以防止水蒸发。在温度18oC ,., 20 oC，于暗处培养。在浸渍开始后24人48h和72h 各拣除一次发芽的麦粒。A.3.4 结果计算如4mL水，120且大麦发芽的百分数(W1)按式(A.1)计算，数值以%表示。研1= 100 - n ( A.1 ) 加8mL水，120h大麦发芽粒的百分数(W2)按式(A.2)计算，数值以%表示。在2= 100 n 试样的水敏感性(W3)按式(A.3)计算，数值以%表示。W3二工研，在2式中zn一一不发芽粒数吭一一试样的水敏感性，%。所得结果表示至整数。A.3.5 精窜度在重复性条件下获得的两次强立望tl定结果的绝对差值不得超过算*平均值的3%。. ( A.2 ) . ( A.3 ) OONj2RH筒。嚣华人民共和国家标准啤酒大麦GB/丁74162008中4峰中摘栋准出强社出版发行t京复兴门外三里掏北街16号邮政编码:100045商桂www.
