1、ICS 67060X 04 a亘中华人民共和国国家标准GBT 7628-2008代替GBT 7628-19872008-05-27发布谷物中维生素B，测定Determination of vitamin B1 in cereals200810-01实施宰瞀徽紫瓣警糌赞星发布中国国家标准化管理委员会仪1”刖 置GBT 7628-2008本标准参考了AACC Method 8680(Thiamine-Thiochrome Method(2000年英文版)。本标准是对GBT 7628-1987谷物维生素B1测定方法的修订。本标准与GBT 7628一1987的主要差异如下：规定了实验用水应符合GBT
2、6682中三级水的规格；规定了扦样、分样方法；盐酸水解改为硫酸水解；增加了硅酸盐离子交换树脂的使用；将正丁醇溶剂改为异丁醇溶剂；提取液色泽浅、无干扰物质时，不需进行提纯步骤；取消以干基计算测定结果的要求；增加了未通过提纯的试样中维生素B，含量的计算公式；增加了谷物中维生素B1低含量时的测定重复性的要求。本标准由国家粮食局提出。本标准由全国粮油标准化技术委员会归口。本标准起草单位：国家粮食局武汉粮油饲料质量监督检验中心。本标准主要起草人：杨林、刘小敏、屈利文、何一帆、钱畴。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：GBT 762819871范围谷物中维生素B，测定GBT 7628-2008本标准规定
3、了用荧光分光光度计测定谷物中维生素B。的原理、试剂和材料、仪器设备、试样制备、分析步骤、结果计算及重复性。本标准适用于谷物中维生素B，的测定。本标准检出限为005 pg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB 5491粮食、油料检验扦样、分样法GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 66823原理试样经稀硫酸、淀粉酶分解后，溶液中维生素B1(硫胺素
4、，c。：H，ON。SCl)在碱性条件下被铁氰化钾氧化生成硫色素，即荧光色素。硫色素在异丁醇中的荧光强度与试样中维生素B1的含量成正比，依此测定维生素B。含量。4试剂和材料除另有规定外，所用试剂均为分析纯，实验用水应符合GBT 6682中三级水的规格。41盐酸42 乙酸钠溶液c(CH3CooNa)=25 molL取205 g无水乙酸钠或340 g水合乙酸钠(CH。COONa3H20)溶于水中，稀释至1 000 mL。43 乙酸溶液c(CH，c00H)=3(体积分数)取30 mL冰乙酸用水稀释至1 000 mL。44氯化钾溶液cxcl)=025 gmL称取250 g氯化钾溶解于水中，稀释至1 00
5、0 mL。45硝酸银溶液c(AgN03)=001 gmL称取1 g硝酸银溶解于水中，稀释至100 mL。46淀粉酶悬浮液c=006 gmL取6 g淀粉酶制剂(takadiastase)，其活性为1：250或相当活性的其他磷酸酯酶，用z5 molL乙酸钠溶液(42)制成悬浮液，稀释至100 mL，当日制备当日使用。47硅酸盐离子交换剂471活性沸石将沸石按规定筛层进行筛选，称取通过上层筛(孔径o297 mm，50目)、留存在下层筛(孔径o177mm，80目)上的沸石100 g于布氏漏斗中，用3的热乙酸(43，约50)溶液洗涤15min，应使乙酸与沸石保持接触10 min15 rain，用真空泵减
6、压抽滤乙酸；再用025 gmL的热氯化钾溶液(44，约50)250 mL进行洗涤；最后用热水(约50C)洗涤，直至洗出液用硝酸银(45)检查时不出现1GBT 7628-2008氯离子。在室温或低于100*C烘箱中将沸石干燥后，在干燥器中冷却至室温，储存于磨口瓶中备用。472硅酸盐离子交换树脂，Bio-Rex70(H型)将硅酸盐离子交换树脂按规定筛层进行筛选，称取通过上层筛(孔径0297 mm，50目)、留存在下层筛(孔径o149mm，100目)1-的硅酸盐离子交换树脂50 g，加入300mL盐酸(41)，振摇10min15 min，将酸倒出，再加300 mL水，振摇1 min，将水倒出。重复数
7、次，直至树脂的pH为4570，抽滤或离心除去多余的水分，冷藏储存(4)。当时使用，可以不除去多余的水分。48氢氧化钠溶液c(NaOII)=015 gmL将15 g氢氧化钠溶于水中，冷却，稀释至100 mL。49铁氰化钾溶液cK3Fe(CN)e=001 gmL将1 g铁氰化钾溶于水中，稀释至100 mL，贮存在具塞棕色瓶中，置于阴凉处保存。410碱性铁氰化钾取001 gmL铁氰化钾溶液(49)3 mL，用015 gmL氢氧化钠溶液(48)稀释定容至100 mL，现配现用。也可以按每3 mL氢氧化钠溶液(48)加入1滴铁氰化钾溶液(49)混合配制。411异丁醇(CH3)2CHCH20n3空白荧光值
8、应低于硫胺素标准工作溶液()(4123)的荧光值的1。否则，应将异丁醇在全玻璃仪器上蒸馏，或加入活性炭振摇除去荧光杂质。412硫胺素溶液4121 硫胺素标准储备溶液(I)c(CzH，ONSCI)=100 IIgmL将硫胺素盐酸盐放在装有五氧化二磷的干燥器中至少24 h，然后，精确称取100 mg溶于25乙醇(414)中，并用25乙醇稀释定容至1 000 mL。储存于棕色瓶中冷藏(4)，可保存数月。4122硫胺素标准溶液(1I)c(c，2H，70N。SCI)=5 pgmL准确量取5 mL硫胺素标准储备溶液(I)(4121)，用25乙醇(414)稀释，定容至100 mL。4123硫胺素标准工作溶液
9、()c(C12Ht，ONSCI)=02 pgmL准确量取4 mL硫胺素标准溶液()(4122)，用01 molL硫酸(415)稀释定容至100 mL，现配现用。413硫酸奎宁溶液4131硫酸奎宁储备液精确称取100 mg硫酸奎宁，溶于01 molL硫酸(415)中，用01 molL硫酸稀释至l 000 mL，储存于棕色瓶中冷藏保存。若溶液混浊则不可使用。4132硫酸奎宁工作液准确量取3 mL硫酸奎宁储备液(4131)，用01 molL硫酸(419)稀释至1 000 mL，储存于棕色瓶中冷藏保存。414 乙醇溶液25(体积分数)将25 mL无水乙醇加入到水中，稀释定容至100 mL，摇匀。415
10、硫酸溶液c(12n2SO,)=01 molL将28 mL浓硫酸加入到水中，稀释定容至1 000 mL。5仪器设备51荧光分光光度计。52电热恒温水浴：100。53实验室用真空泵。54电热恒温箱：3740。55吸附分离柱(见图1)：容器全长约235 mm；上端储液槽(外径长度)30 mm70 mm，容量为50 mL；中部吸附管(外径长度)8 mmXl30 ram；下端为35 mm的毛细管，其孔径在液体通过时的流2量应控制在不大于1 mLmin。56反应管(见图2)：25 mL具塞刻度玻璃试管。单位为毫米图157分析天平2台：感量01 g，感量01 mg。58实验磨。59容量瓶：i00 mL。51
11、0移液管：2 mL，5 mL，15 mL，25 mL。511注射器：20mL。512金属丝编织网试验筛：孔径o84 mmO513离心机：转速1 800 rrain。514干燥器。6试样制备图2149 ram(20目100目)。GBT 7628-2008单位为毫米61按GB 5491进行扦样、分样。62粒状样品：用实验磨粉碎，通过孔径o84 mE(20目)筛，再用混样器或其他适当方法充分混匀。63粉状样品：称取200 g300 g，通过孔径o84 mm(20目)筛，再用混样器或其他适当方法充分混匀；如有较大颗粒或块状样品，用实验磨粉碎，并通过孔径o84 mm筛(20目)，再用混样器或其他适当方法
12、充分混匀。7分析步骤71称样根据试样中硫胺素含量，按表1的推荐称样量精确称取试样，置于i00 mL容量瓶中。表1试样量及样液体积试样中硫胺素含量(X)(mgkg) 试样量(m)g 加人到离子交换柱的样液体积(y一)mL 收集洗脱液体积(U)mL011 4 20 151338 3 20 154O66 2 20 1568-132 l 20 1513422O 1 10 15222440 1 5 1544以上 1 2 25硫胺素标准工作液 25 25GBT 7628-200872提取加入01 molL硫酸(415)50 mL到容量瓶(71)中，在100C电热恒温水浴中加热10 min，并不时摇动容量瓶
13、，以防结块。73酶解冷却容量瓶(72)至40C以下，加入5 mL淀粉酶悬浮液(46)，充分混匀，在376C40温度环境中至少放置4 h，冷却至室温，用水稀释定容至100 mL，摇匀，将试液通过滤纸干过滤，弃去最初的5 mL滤液后再收集滤液于锥形瓶中，作为样品提取液。如提取液色泽浅、无干扰物质时，不需进行提纯步骤，按76进行氧化操作。测定结果按第8章的式(1)计算。74净化7。4，1 当提取液色泽很深或含有于扰物质时，按742、7。4。3、744的步骤净化，测定结果按第8章的式(2)计算。742取适量玻璃棉置于吸附分离柱吸附管底都，然后将05 g活性沸石(471)或制备好的硅酸盐离子交换树脂(4
14、72)放入吸附管，在使用前用沸水充分洗涤吸附分离柱。743准确移取适量体积见表1(y。)的样液，加入到已处理好的吸附分离柱中(吸附剂应保持被沸水完全浸泡)，用5 mL热水(约50)洗涤吸附分离柱，连续操作三次，弃去洗出液，以确保硫胺素在柱上分配完全。74，4取适量煮沸的025 gmL氯化钾溶液(44)，分三次连续加入吸附分离柱，用25 mL具塞刻度玻璃试管收集洗脱液，收集的洗脱液体积见表1(y。)。冷却后用水稀释定容至25 mL，充分混匀。75外标溶液准确吸取25 mL硫胺素标准工作液(II)(4123)，重复7173操作，作为外标溶液。76氧化分别准确移取5 mL样液(73)或洗脱液(743
15、)于两只具塞离心试管中，编为1号试管和2号试管。在1号具塞离心试管中，加入3 mL碱性铁氰化钾溶液(410)，在2号具塞离心试管中加入3 mL015 gmL氢氧化钠溶液(48)，振摇约30 S；再分别准确加入15 mL异丁醇(411)，剧烈振摇1 min。将1号、2号具塞离心试管置于离心机中以1 800 rmin的速度离心1 rain后，用注射器吸去水层，在异丁醇层中加入1 raL无水乙醇，混匀。77测定771调整荧光分光光度计用硫酸奎宁工作液(4132)调整荧光分光光度计，使其处于正常工作状态。772测定样液的荧光强度将10 mL异丁醇层倒入比色杯中，于激发波长365 nm、发射波长435
16、nm处测定硫胺素的荧光值，分别记录1号试管试液的荧光值R；和2号试管试液空白的荧光值Rn。同时分别准确吸取5mL外标溶液(75)置人另两只具塞离心试管中，编为3号和4号(作为标准空白)，按76操作后，测定3号试管的硫胺素标准工作溶液(II)(4123)的荧光值R。和4号试管的硫胺素标准工作溶液空白的荧光值R一8结果计算未经过提纯的试样中维生素B，含量(x。)按式(1)计算，经过提纯的试样中维生素B。含量(xz)按式(2)计算：4x，一鲁告等v (R。一R工b)VUC2一琢忑jX可丐鬲叉瓦GBT 7628-2008式中：x。未经过提纯的试样中维生素B，含量，单位为毫克每千克(mgkg)；xz经过
17、提纯的试样中维生素Bl含量，单位为毫克每千克(mgkg)；R，一 1号管试液的荧光值；R。2号管试液空白的荧光值；R，3号管硫胺素标准工作溶液的荧光值；R“4号管硫胺素标准工作溶液空白的荧光值；y：分取过离子交换柱样液的体积，单位为毫升(mL)；y。收集洗脱液体积，单位为毫升(mL)；m试样质量，单位为克(g)；y酶解提取液的体积，单位为毫升(mL)；c硫胺素标准工作溶液的浓度，单位为微克每毫升(pgraL)；x。参与反应样品溶液体积与参与反应标准溶液体积的比值(通常551)。每个试样进行平行试验，以算术平均值为测定结果。计算结果保留3位有效数字。9重复性同一分析者对同一试样在同样条件下同时进行两次测定：当维生素B1含量X50 mgkg时，其获得的两次独立测定结果的相对偏差应15；当维生素B。含量x50 mgkg时，其获得的两次独立测定结果的相对偏差应10；当维生素B，含量x500 mgkg时，其获得的两次独立测定结果的相对偏差应5。
