1、中华人民共和国国家标准化妆品微生物标准检验方法粪大肠菌群Standard methods of microbiological examlnatlon for cosmetics Fe四1collforms UDC 668. 58 576 . 85- 07 GB 7 91 8. 3 8 7 粪大肠菌群细菌来源于人和温血动物的粪便检出粪大肠菌群表明该化妆品已被粪便污染，有可能存在其他肠道致病菌或寄生虫等病原体的危险因此粪大肠菌被列为重要的卫生指标菌。1 方法提要根据粪大肠菌群所具有的生物特性，如革兰氏阴性无芽胞杆菌在44培养2448h能发酵乳糖产酸并产气，能在选择性培养基上产生典型菌藩，能分解色
2、氨酸产生自童基质2 培鼻基和试11112. 1 乳糖胆盐培养基成分z蛋白陈20g 猪阻盐5g 乳糖5g 0. 4%澳甲盼紫水溶液2. 5mi 蒸馆水!OOOml 制法：将蛋白旅、胆盐及乳糖溶于蒸馆水中，调pH到7.4，加入指示剂混匀，分装试管每支试管中加一个小倒管115（10ib)20min灭菌2. 2 双倍浓度乳糖胆盐培养基按上述乳糖胆盐培养基成分，蒸锢水量不变，其他成分量加倍2. 3 伊红美蓝（EMB）琼脂成分z蛋白陈乳糖磷酸氢二御琼脂2%伊红水溶液lOg lOg 2g 20g 20ml o. 5%美蓝水溶液13ml 蒸馆水lOOOmi 和j法g先将琼脂加j!J900mi蒸饱水中，加热溶解
3、，然后加入磷酸氢二饵蛋白陈，混匀，使之溶解。再以蒸馈水补足至lOOOmi0校正pH值为7.2 7. 4，分装于烧瓶内，121（15lb) 15 min高压灭菌备用。l脑用时加入乳糖并加热融化琼脂冷至60C左右以无菌手续加入灭菌的伊红美蓝溶液，摇匀。倾注平皿备用。中华人民共和国卫生部1987-05-28批准1987 10-01实施140 2. 4 蛋白陈水（作能基质试验用成分z蛋白陈（或膜蛋白陈氯化锅蒸馆水GB 7 9 1 8 . 3 - 8 7 20g Sg I OOOml 制法s将上述成分加热熔化，调pH值为7.0 7. 2，分装小试管，高压灭菌121（15lb)15min, 2. 5 髓基
4、质试剂柯凡克试剂z将Sg对二甲氨基苯甲醒溶解于75ml戊醇中，然后缓慢加入浓盐酸25ml。试验方法z接种细菌于蛋白陈水中，于44培养24h.沿管壁加柯凡克试剂。.3 O. Sm！，轻摇试管。阳性者于试剂层显深玫瑰红色。注z蛋白陈应含有丰富的色氨酸，每批蛋白陈买来后，应先用己知菌种鉴定后方可使用2. 6 革兰氏染色法2. s. 1 染液制备2.s.1.1 结晶紫染色液结晶紫lg 95%酒精20ml 1%草酸镀水溶液80ml 将结晶紫溶于酒精中，然后与事酸镀溶液混合2.s. 1.2 革兰氏映液z破lg模化惆2g 蒸饱水300ml 将破与破化饵先进行混合，加入蒸馆水少许，充分摄播，待完全溶解后，再加
5、燕馆水至300ml。2.s.1.3 脱色液，95%乙醇2.s. 1.4 复染液E. 沙黄复染液沙黄0.25g 95%酒精!Om! 蒸馈水90ml 将t9、黄溶解于酒精中，然后用蒸馆水稀释b. 稀石碳酸复红液称取碱性复红！Og，研细，加95%乙醇！OOml，放置过夜，滤纸过滤。取该液lOml，加5%石碳酸水溶液90ml混合，即为石碳酸复红液再取此液！Om！加水90时，即为稀石碳酸复红液。2.s.2 染色法2.s.2.1 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染！min，水洗2.s.2.2 滴加革兰氏碗液，作用！min，水洗2.s.2. 3 滴加95%酒精脱色，约30s，或将酒精滴满整个涂片，立即
6、倾去再用酒精滴满整个涂片，脱色！Os，水洗。2.s. 2. 4 滴加复染液，复染lmin，水洗，待干，镜检2. 6. 3 染色结果革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。rt，如用l I 0稀释有碳酸复红染鱼液作复染液复杂时间仅需IOs, 3仪器3. 1 恒温水浴或隔水式恒温箱，44。I 4 I GB 7918. 3-87 3, 2 温度计。3, 3 显微镜。3, 4 载玻片。3, 5接种环。3, 6 电炉。3, 7 锥形瓶。3. 8 试管。3, 9 小倒管。3. 10 pH汁或pH试纸3, 11 高压消毒锅3, 12 灭菌吸管3. 13 灭菌平皿4 操作步骤4, 1 取lOm! I I 0稀
7、释的样品，加到！Om！双倍浓度的乳糖胆盐培养基中，置44培养箱中培养2448h，如不产酸也不产气，则报告为粪大肠菌群阴性。4.2 如产酸产气，如j线接种到伊红美蓝琼脂平板上置37培养1824h0同时取该培养液12滴接种到蛋白陈水中，置44培养24h。经培养后，在上述平板上观察有无典型菌落生长。大肠菌群在伊红美蓝琼脂培养基上的典型菌落呈深紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉紫色，中心较深的菌落亦常为大肠菌群，均应注意挑选4. 3 挑取上述可疑菌落，涂片作革兰氏染色镜检4, 4 在蛋白陈水培养液中，加入使基质试剂约o.5时，观察院基质反应。阳性者液面呈玫瑰红色，阴性反应液面呈试剂本色5检验结果报告平板上有典型菌落并经证实为革兰氏阴性短杆菌，能基质试验阳性，则可报告被检样晶中检出粪大肠菌群。附加说明2本标准由中国预防医学科学院环境卫生监测所归口本标准由“化妆品微生物标准检验方法”起草小组起草本标准主要起草人周淑玉。本标准由中国预防医学科学院环境卫生监测所负责解释。112
