1、ICS 65. 120 B 46 道国中华人民共和国国家标准GB/T 838 1.2-2005 饲料中志贺氏菌的检测方法Determination of Shigellin feed 2005-09-05发布2006皿02-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局也士中国国家标准化管理委员会0.I IJ GB/T 8381.2-2005 前言本标准参照采用GB/T4789.5(食品卫生微生物学检验志贺氏菌检验的有关内容。本标准的附录A、附录B为规范性附录。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。本标准起草单位:国家饲料质量监督检验中心(北京)。
2、本标准主要起草人z饶正华、李丽蓓、杨曙明、苏晓鸥。I 饲料中志贺氏菌的检测方法1 范围本标准规定了饲料中志贺氏菌的检测方法。本标准适用于饲料中志贺氏菌的检测。2 规范性引用文件GB/T 8381.2-2005 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 14699. 1饲料采样3 设备和材料3. 1 天平:感量1g，最大称量1000 g。3.2 均质器或乳钵。3.3 恒温培养箱
3、。3.4 显微镜。3.5 灭商广口瓶:500mL。3.6 灭菌三角烧瓶:500mL, 250 mL。3. 7 灭菌平皿z皿底直径90mm。3.8 载玻片。3.9 酒精灯。3.10 灭菌金属匙或玻璃棒。3. 11 接种棒，镰铭丝。3.12 试管架。3. 13 硝酸纤维素滤膜:150 mmX 50 mm，O. 45m。临用时切成两张，每张70mmX50 mm，用铅笔划格，每格6mmX6 mm。每行10格，分6行。灭菌备用。4 培养基和试剂除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸榴水(或去离子水，或相当纯度的水)。4.1 GN增菌液z见附录B的B.1章。4.2 HE琼脂z见附录B的B.2章
4、。4.3 SS琼脂:见附录B的B.3章。4.4 麦康凯琼脂:见附录B的B.4章。4.5 伊红美蓝琼脂(EMB):见附录B的B.5章。4.6 三糖铁琼脂(TSD:见附录B的B.6章。4.7 葡萄糖半固体管z见附录B的B.7章。4.8 半固体管:见附录B的B.8章。4.9 葡萄糖镀琼脂z见附录B的B.9章。4.10 尿素琼脂(pH7.2):见附录B的B.10章。GB/ T 8381 .2-2005 4. 11 西蒙氏拧攘酸盐琼脂:见附录B的B.11章。4.12 氨化押(KCN)培养基:见附录B的B.12章。4. 13 氨基酸脱竣酶试验培养基:赖氨酸、鸟氨酸及对照培养基，见附录B的B.13章。4.
5、14 糖发酵管:棉子糖、甘露醇、甘油、七叶昔及水杨昔，见附录B的B.14章。4.15 5%乳糖发酵管:见附录B的B.15章。4. 16 蛋白陈水、薛基质试剂:见附录B的B.16章。4. 17 志贺氏菌属诊断血清。5 试样的制备表性、在运输和贮存过程中没有发5. 1 采样应在无菌操作下进5. 2 采样工具，如探子、铲5. 3 根据样品种类如袋、样品是固体粉末，应边取超过3h。如果路途遥6. 1 增菌称取饲料试料6 h8 h。培养时6. 2 分离和初步6.2. 1 取增菌液l于麦康凯琼脂(B.4养基上呈现无色透6.2. 2 挑取平板上个菌落，以防遗漏，经b)在18h24 h内c) 不分解葡萄糖和只
6、d) 产气的培养物;e) 有动力的培养物;f) 产生硫化氢的培养物。6. 2. 4 凡是乳糖、煎糖不发酵，葡萄糖产酸不株，可做血清学分型和进一步的生化试验。6. 3 血清学分型和进一步的生化试验6. 3. 1 血清学分型环划线接种菌在这些培一般应多挑几挑取三糖铁琼脂上的培养物，做玻片凝集试验。先用4种志贺氏菌多价血清(4.17)检查，如果由于K抗原的存在而不出现凝集，应将菌液煮沸后再检查;如果呈现凝集，则用A1, A2 ，B群多价和D群血清分别试验。如系B群福氏志贺氏菌，则用群和型因子血清分别检查。福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原见表1。可先用群因子血清检查，再根据群因子血清出现凝集的结果，
7、依次选用型因子血清检查。GB/T 8381.2一20054种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株，可用鲍氏多价1、2、3分别检查，并进一步用115各型因子血清检查。如果鲍氏多价血清不凝集，可用铜疾志贺氏菌312型多价血清及各型因子血清检查。表1福氏志贺氏菌备型和亚型的型抗原和群抗原在群因子血清中的凝集生化群A群:病疾志贺氏菌B群:福氏志贺氏菌C群:鲍氏志贺氏菌- I 十D群:宋内氏志贺氏菌+/C十J+ + 注:十阳性;一阴性;一/十多数阳性;C + J迟缓阳性;d有不同生化型。6.4 结果报告综合生化和血清学的试验结果判定菌型并作出报告。型和亚型型抗原la I lb I 2a H 2b H 3a 皿3
8、b E 4a N 4b N 5a V 5b V 群抗原3,4 6 7,8 1,2 ,4 ,5,9 十1,2 ,4 ,5,9 + + 1,3 ,4 - -. + 十+ 6 X变体Y变体注:十凝集;一6.3.2 进一步的在做血清学分十(B. 14)。除宋内氏做革兰氏染色检查和盐(B.11)，赖七叶昔的分解。必要时还应己判定为志贺氏(B. 14)和蘸基质试验(B.的生化特性与A群或C群子糖和甘油的发酵C+J 时-2+飞J+d fL 3 GB/T 8381.2-2005 附录A(规范性附录)检验程序圄36C士1C，6 h-8 h 36C士1C，18 h-24 h TSI底层产酸，斜商产碱，H2S (-
9、) ，不产气，无动力4 葡萄糖镀试验、西蒙氏拧橡醺盐、赖氨酸、尿素、KCN、水杨苦和七叶普固A.1检验程序固非如左述的各种反应结果B.1 GN增菌液B. 1. 1 成分膜蛋白陈葡萄糖甘露醇拧穰酸铀去氧胆酸铀磷酸氢二饵磷酸二氢饵氯化铀蒸懵水pH7.0 B. 1.2 制法20 g 1 g 2 g 5 g 附录B(规范性附录)培养基和试剂制备0.5 g 4g 1. 5g 5 g 1 000 mL GB/T 8381.2-2005 按上述成分配好，加热使溶解，校正pH。分装每瓶225mL，1l50C高压灭菌15min。B.2 HE琼脂(HektoenEnteric Agar) B.2.1 成分际陈牛肉
10、膏乳糖蔚糖水杨素胆盐氯化铀琼脂蒸馆水0.4%澳靡香草酣蓝榕液Andrade指示剂z将酸性复红O.5 g溶于100mL蒸锢水中，加入氢氧化铀榕液c(NaOH)=lmol/LJ16 mL，数小时后如复红褪色不全，再加氢氧化锅溶液1mL2 mL 甲液:硫代硫酸铀34g，拧橡酸铁镀4g溶于100mL蒸馆水中乙液:去氧胆酸锅10g溶于100mL蒸馆水中pH7.0 B.2.2 制法12 g 3 g 12 g 12 g 2 g 20 g 5 g 1820 g 1 000 mL 16 mL 20 mL 20 mL 20 mL 将前面七种成分溶解于400mL蒸馆水内作为基础液p将琼脂加入于600mL蒸榴水内，加
11、热榕解。加入甲液和乙液于基础液内，校正pH。再加入指示剂，并与琼脂液合并，待冷至500C550C，倾注平板。注g此培养基不可高压灭菌。5 GB/T 8381.2-2005 B. 3 SS琼脂B. 3.1 基础培养基牛肉膏际陈三号胆盐琼脂蒸馆水再将两液混合，1210C高压灭菌15mi B. 3. 2 完全培养基基础培养基乳糖拧攘酸铀0.1%煌绿溶液加热溶化基础主红和煌绿溶液，倾俨B. 4 麦康凯琼脂琼脂蒸馆水乳糖5 g 5 g 3. 5 g 17 g 1 000 mL 0.01%结晶紫水恪液10 mL 0.5%中性红水溶液5 mL B. 4. 2 制法于600mL蒸馆水中，煮沸使其榕解，B. 4
12、. 2.1 将蛋白陈、际陈、胆盐和氯化铀溶解于400mL蒸馆水中，校正pH7.2。将琼脂加入600mL 蒸馆水中，加热榕解。将两液合井，分装于烧瓶内，1210C高压灭菌15min备用。B. 4. 2. 2 临用时加热搭化琼脂，趁热加入乳糖，冷至500C550C时，加入结晶紫和中性红水恪液，摇匀后倾注平板。注结晶紫及中性红水溶液配好后须经高压灭菌。6 B. 5 伊红美蓝琼脂(EMB)B. 5.1 成分蛋白陈乳糖磷酸氢二押琼脂2%伊红Y溶液0.65%美蓝榕液蒸馆水pH7.1 B.5.2 制法将蛋白陈、磷酸盐和琼俨临用时加入乳糖并加热溶B.6 B.6.1 成分蛋白陈牛肉膏乳糖N，糖葡萄糖氯化铀硫酸亚
13、铁镀(硫代硫酸铀琼脂酣红蒸饵水pH7.4 B.6.2 制法将除琼脂和酣红以外民入0.2%酣红水榕液12.5m L 15 min。放置高层斜面备用。B.7 葡萄糖半固体管B. 7. 1 成分蛋白陈牛肉膏氧化铀1.6%澳甲酣紫酒精搭液葡萄糖琼脂蒸馆水pH7. 4 10 g 10 g 2 g 17 g 20 mL 1 g 0. 3 g 0.5 g 0.1 mL 1 g 0. 3 g 100 mL GB/T 8381.2一2005离压灭菌15min备用。手匀，倾注平板。7 GB/T 8381.2-2005 B. 7. 2 制法将蛋白脏、牛肉膏和氯化铀加入于水中，校正pH后加入琼脂加热溶解，再加入指示剂
14、和葡萄糖，分装小试管，121.C灭菌15min。B.8 半圄体管B. 8.1 成分蛋白陈牛肉膏氯化铀琼脂蒸馆水1 g 0.3 g 0.5 g O. 350. 4 g 100 mL pH7.4 B.8.2 制法按以上成分配好，煮沸使溶解，并校正pH。分装小试管。121.C高压灭菌15mino直立凝固备用。注:供动力观察、菌种保存、H抗原位相变异试验等用。B.9 葡萄糖镀培养基B. 9.1 成分氯化铀硫酸镜(MgS04 7H20) 磷酸二氢镀磷酸氢二饵葡萄糖琼脂蒸馆水0.2%澳靡香草酣蓝溶液5 g 0.2 g 1 g 1 g 2 g 20 g 1000 mL 40 mL pH6.8 B.9.2 司
15、司法先将盐类和糖溶解于水内，校正pH，再加琼脂，加热榕化，然后加入指示剂，混合均匀后分装试管，121.C高压灭菌15min，放成斜面。B.9.3 试验方法用接种针轻轻触及培养物的表面，在盐水管内做成极稀的悬液，肉眼观察不见混浊，以每一接种环内含菌数在20100之间为宜。将接种环灭菌后挑取菌液接种，同时再以同法接种普通斜面一支作为对照。于36.C士1.C培养24h。阳性者葡萄糖镀斜面上有正常大小的菌落生长;阴性者不生长，但在对照培养基上生长良好。如在葡萄糖镀斜面生长极微小的菌落可视为阴性结果。注g容器使用前应用清洁液浸泡。再用清水、蒸馆水冲洗干净，并用新棉花做成棉塞，干热灭菌后使用。如果操作时不
16、注意，有杂质污染时，易造成假阳性的结果。B. 10 尿素琼脂(pH7.2)B. 10. 1 成分蛋白陈氯化铀葡萄糖gbgbub -4Fhu唱i8 磷酸二氢梆0.4%酣红榕液琼脂蒸锢水20%尿素榕液pH7.2士0.1B.10.2 制法GB/T 8381.2-2005 2 g 3 mL 20 g 1 000 mL 100 mL 将除尿素和琼脂以外的成分配好，并校正pH，加入琼脂，加热榕化并分装烧瓶。121.C高压灭菌15 min。冷至50.C55.C，加入经除菌过滤的尿素溶液。尿素的最终浓度为2%，最终pH应为7.2:l:0.1.分装于灭菌试管内，放成斜面备用。B.10.3 试验方法挑取琼脂培养物
17、接种，在36.C土1.C培养24h，观察结果。尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。B. 11 西蒙氏拧槽酸盐培养基B. 11. 1 成分氯化铀硫酸镜(MgS04 7H20) 磷酸二氢镀磷酸氢二饵拧攘酸铀琼脂蒸铺水0.2%澳靡香草酣蓝榕液pH6.8 B. 11.2 制法5 g 0.2 g 1 g 1 g 5 g 20 g 1 000 mL 40 mL 先将盐类溶解于水内，校正pH，再加琼脂，加热溶化。然后加入指示剂，漉合均匀后分装试管，121.C高压灭菌15min。放成斜面。B. 11. 3 试验方法挑取少量琼脂培养物接种，于36.C土1.C培养4d，每天观察结果。阳性者斜面上有菌落生长，培
18、养基从绿色转为蓝色。B.12 .化饵(KCN)培养基B. 12. 1 成分蛋白陈氯化铀磷酸二氢梆磷酸氢二铀蒸锢水0.5%辄化饵溶液pH7.6 B. 12.2 制法10 g 5 g 0.225 g 5.64 g 1 000 mL 20 mL 将除氟化饵以外的成分配好后分装烧瓶，121.C高压灭菌15min。放在冰箱内使其充分冷却。每GB/T 8381.2-2005 100 mL培养基加入0.5%氟化伺洛液2.0mL(最后浓度为1: 10 000)，分装于12mm X 100 mm灭菌试管，每管约4mL，立刻用灭菌橡皮塞塞紧，放在40C冰箱内，至少可保存两个月。同时，将不加氯化押的培养基作为对照培
19、养基，分装试管备用。B. 12. 3 试验方法将琼脂培养物接种于蛋白脏、水内成为稀释菌液，挑取1环接种于氧化饵CKCN)培养基。并另挑取l环接种于对照培养基。在360C:!:lOC培养1d2 d，观察结果。如有细菌生长即为阳性(不抑制)，经2 d细菌不生长为阴性(抑制)。警告:霞化饵是剧毒药物，使用时应小心，切勿沾染，以免中毒。夏天分装培养基应在冰箱内进行。B.13 B. 13 . 1 成分蛋白陈酵母浸膏葡萄糖蒸馆水不加氨基酸。从琼脂斜于产碱，培养基黄色。B.14 糖发酵管B. 14. 1 成分牛肉膏蛋白陈氯化铀磷酸氢二铀CNa2HP04 12 H2) 0.2%澳靡香草酣蓝海液蒸馆水pH 7.
20、 4 B. 14.2 制法逐渐分解，产生氢篝酸气体逸出，以致药物浓度降6. 8。对照培养基12 mL 1 000 mL B. 14.2.1 葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按0.5%加入葡萄糖，分装于有一个倒置小管的小试管内，1210C高压灭菌15min o B. 14.2. 2 其他各种糖发酵管可按上述成分配好后，分装每瓶100mL, 121 oC高压灭菌15min。另将各种糖类分别配好10%溶液，同时高压灭菌。将5mL糖溶准加入于100mL培养基内，以无菌操作分GB/T 838 1.2-2005 装小试管。注:lW，糖不纯，加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。B.14.3 试验方法从琼脂斜
21、面上挑取小量培养物接种，于360C:f:10C培养，一般观察2d3 d。迟缓反应需观察14 d30 d。B.15 5%乳糖发酵管B. 15. 1 成分蛋白陈氯化铀乳糖2%澳靡香草酣蓝榕液蒸锢水pH7.4 B. 15.2 制法0.2 g 0.5 g 5 g 1. 2 mL 100 mL 除乳糖以外的各成分溶解于50mL蒸锢水内，校正pH。将乳糖溶解于另外50mL蒸馆水内，分别于1210C高压灭菌15min，将两液混合，以无菌操作分装于灭菌小试管内。注:在此培养基内，大部分乳糖迟缓发酵的细菌可于d内发酵。B.16 蛋白陈水(黠基质试验用)B. 16. 1 成分蛋白陈(或膜蛋白陈)氯化铀蒸馆水pH7
22、.4 B. 16.2 制法20 g 5 g 1 000 mL 将上述成分配制，分装小试管，1210C高压灭菌15min。B. 16.3 髓基质试剂B. 16.3. 1 柯凡克试剂:将5g对二甲氨基苯甲醒榕解于75mL戊醇中，然后缓慢加入被盐酸。B.16.3.2 欧一波试剂:将1g对二甲氨基苯甲醒榕解于95mL 95%乙醇内，然后缓慢加入浓盐酸20 mLo B.16.4 试验方法挑取小量培养物接种，在360C士lOC培养1d2 d，必要时可培养4d5 d。加入柯凡克试剂约0.5 mL，轻摇试管，阳性者于试剂层皇深红色;或加入欧-波试剂约0.5mL，沿管壁流下，覆盖于培养液表面，阳性者于液面接触处
23、呈玫瑰红色。注:蛋白陈中应含有丰富的色氨酸。每批蛋白陈买来后，应先用己知菌种鉴定后方可使用。mCON-NJMW的H菌。华人民共和国家标准饲料中志贺氏菌的检测方法GB/T 838 1. 2-2005 国由峰中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销4峰印张1字数23千字2006年2月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2006年2月第一版定价12.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)685335339峰书号:155066 1-26935
