1、ICS 65. 120 B 46 道昌中华人民共和国国家标准G/T 8381. 4-2005 配合饲料中T-2毒素的测定薄层色谱法Method for determination of T-2 toxin in formula feed Thin layer chromatography 2005-09-05发布中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会2006-02-01实施发布GB/T 8381.4-2005 前言本标准参考了GB/T14933-1994(小麦中T-2毒素的酶联免疫吸附测定方法。本标准与GB/T14933-1994的主要差异如下z一一将GB/T14933
2、-1994中5.2.2.1的活性炭用量的表述加入O.4g活性炭修改为加入O.5g活性炭。这是为了减少流出液中夹带的干扰性杂质;一一将GB/T14926. 5一1994中酶联免疫吸附测定改为薄层色谱测定;一一修改了其中不符合GB/T20001. 4-2001(标准编写规则第4部分z化学分析方法之处。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。本标准由农业部饲料质量监督检验测试中心(沈阳)负责起草，吉林省兽药监察所和国家饲料质量监督检验中心(北京)参加起草。本标准主要起草人:陈莹莹、曹东、董永亮、战石、李雪兰、李广生、刘同民、杨曙明。I 1 范围配合饲料中T-2毒素
3、的测定薄层色谱法本标准规定了测定配合饲料中T-2毒素的薄层色谱方法。本方法的检出限为1mg/kg。2 规范性引用文件的修改单(不包括勘误是否可使用这些文件GB/ T 14699. 1 3 原理4 试荆除非另有说4.1 T-2毒素标4.2 无水乙醇。4.3 4.4 4.5 4. 6 4. 7 4.8 甲醇-水，4十1。4.9 甲醇丙自同，1十2。4. 10 竣甲基纤维素铀溶液，0.5%。4. 11 苯乙酶，1+1。4.12 甲苯乙酸乙醋甲酸，6+3+1。4.13 硫酸乙醇溶液，取市售硫酸20mL，用乙醇稀释至100mL。4.14 中性氧化铝，层析用，经3000C活化4h，置干燥器中备用。GBjT
4、 838 1. 4一2005检出量来测定4.15 活性炭:取20g活性炭，用27%(体积分数)盐酸榕液浸泡过夜、抽滤后，用热蒸锢水洗至无氯离1) T-4887是美国Sna公司的商品代号。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。G/T 8381. 4-2005 子，在1200C烘干备用。4. 16 T-2毒素标准品播液:称取T-2毒素标准品(4.1)25.0mg，精确到0.1mg.用无水乙醇(4.2)溶解，转入50mL量瓶中，再用无水乙醇稀释至刻度，此溶液含T-2毒素0.5mg/mL。吸取此标准溶液1. 0 mL，用无
5、水乙醇稀释至10mL，此溶液含T-2毒素50g/mL。5 仪器和设备5. 1 分析天平z感量0.0001 g。5.2 天平:感量0.01go 5.3 小型粉碎机。5.4 电动震荡器。5.5 旋转蒸发器。5.6 层析柱z内径2cm，长10cm。5. 7 具塞浓缩瓶z容量10mL，底部具0.2mL刻度尾管。5.8 玻璃板:规格5cmX 20 cm o 5.9 薄层涂布器:涂布厚度0.3mm。5. 10 展开槽:卧式，内长25cm，宽6cm，高4cm;立式，内长10cm，宽6cm，高25cm。5. 11 紫外光灯:波长365nm。5.12 微量注射器:10L、25Lo6 试样的制备将按GB/T146
6、99. 1取得的样品，四分法缩分，取约200g，经粉碎，全部过1mm孔筛，昆匀，装入磨口瓶中备用。7 测定步骤7. 1 提取称取20g试样(6)，精确到0.01g.置200mL具塞锥形瓶中，加8mL水和100mL三氯甲皖无水乙醇(4.7)，密塞，在瓶塞上涂层水，盖严防漏。振荡1h，通过折叠快速定性滤纸过滤，取25mL滤液于100 mL蒸发瓶中，置旋转蒸发器(5.5)上450C减压蒸发至干。7.2 净化7.2.1 液液分配用100mL石油酷(4.3)分次榕解蒸发瓶中的残渣，洗人250mL分液漏斗中，再用30mL甲醇-水(4.8)分次洗搔蒸发瓶，转入同一分液漏斗。振摇分液漏斗1.5 min，静置约
7、15min，使分层后，将下层甲醇-7.(提取液过净化柱，不要将两交界处的白色絮物放入柱内。7.2.2 桂净化在层析柱(5.6)下端塞约0.1g脱脂棉，尽量塞紧，先装入。:5 g中性氧化铝(4.14)，敲平表面，再加入0.5g活性炭(4.1日，敲紧。将层析柱下端插入胶塞，塞在抽滤瓶上，抽滤瓶中放入一平底管接收流出液。打开真空泵，使活性炭压紧，将分液漏斗中的甲醇-水提取液小心地沿管壁加人柱内，控制流速不超过3mL/min，提取液过柱快完毕时，加入10mL甲醇-7.(淋洗柱，继续抽滤，直至不再有液体流出。7.3 试料溶麓的制备过柱后的流出液(7.2.2)转入100mL蒸发瓶中，置旋转蒸发器上，450
8、C减压蒸发至干。取下蒸发瓶置沸水浴上至完全干燥，趁热加入3mL乙酸乙醋(4.4)，加热至沸腾，在水浴上轻轻地反复摇动蒸发瓶，使残渣中的T-2毒素溶出，冷却至室温后转入浓缩瓶(5.7)中。加约0.5mL甲醇-丙酣(4.9)于蒸发瓶中，超声破碎残渣，将蒸发瓶置水浴上挥干溶剂后，加入3mL乙酸乙醋，加热至沸，转动蒸发瓶，使充GB/T 8381.4-2005 分沸腾，冷却至室温后转入同一浓缩瓶中，再用0.5mL甲醇-丙酣和3mL乙酸乙醋同样处理一次，乙酸乙醋并入浓缩瓶中。将浓缩瓶置约95.C水浴上，蒸汽加热浓缩至干，冷却至室温后，准确加入0.2mL 丙酣(4.5)溶解残渣留做薄层层析用。7.4 测定7
9、.4. 1 薄层饭的制备取4g硅胶G(4.6)，加竣甲基纤维素铀搭液(4.10)约11mL，研磨2min至呈粘稠状，铺成5cmX 20 cm的薄层板(5.8)三块，置室温干燥后，于105.C活化2h3 h，贮干燥器中备用。7.4.2 点样在每块薄层板(7.4.1)距下端2.5cm处为基线点样。在距板左边缘O.8 cml cm处点试料榕液(7.3)2L，在距左边缘2.0cm处点1L标准品榕液(4.16)，在距右边缘1.2 cm处点2L标准品榕液。再在距板上端1.5 cm处点三个标准品榕液各2L，使之与基线上三个点的位置相对应。7.4.3 展开7.4.3. 1 横展以苯乙酷(4.11)为横展剂，在
10、卧式展开槽内倒人10mL展开剂，将点好样的薄层板靠试料搭液点的长边斜浸入展开剂，展至板端过1min2 min，使试料中的T-2毒素偏离原点O.7 cml cm，取出通风挥干3min。再用10mL石油醋。O.C60.C)横展一次，展至板端过1min，取出通风挥干5min。7.4.3.2 纵展以甲苯-乙酸乙醋-甲酸(4.12)为纵展剂。将横展挥干后的薄层板置立式展开槽内纵展15cm。取出通风挥干约10mino 7.4.3.3 显影用硫酸乙醇榕液(4.13)均匀喷布己展毕的薄层板使恰好润湿，如果喷布的洛液少，斑点不易显现，太多会使斑点扩散，不易观察。置110.C烘箱中加热3min5 min，注意观察
11、，薄层板略着色后，立即取出，冷却1min5 min后，于紫外光灯(5.11)下观察。7.4.4 观察与评定薄层板经横展后，试料溶液点中的T-2毒素向右移动约O.7 cml cm，使其摆脱了杂质荧光的干扰。薄层板上端未经纵展的三个标准品点可分别作为横展后试料溶液中T-2毒素和两个标准品点的定位点。试料榕液中的T-2毒素点又可与纵展后的标准品点比较Rf值而定位。从横向和纵向两个方向确定试料溶液T-2毒素点的位置，达到定性的目的。如果在薄层板上与标准荧光斑点对应处未见试料榕液中的被测物斑点，则需按上述方法重新点第二块板，只是在点完试料搭液后，在样点处再滴加1L标准品溶液，与第一块板同样展开、显荧光。
12、如果第二块板上试料榕液加1L标准品榕液所显荧光强度与1L标准溶液相同，则试样中T-2毒素为阴性或含量在1mg/kg以下。阳性试样可通过稀释试料溶液或调整点样量直至所产生斑点的荧光强度与1L标准品溶液所显荧光强度相同进行定量。虽然基线上的三个T-2毒素点在横展中都稍有移动，但对各点荧光强度无影响，两个标准品点均可用于和试料榕液点比较荧光强度。mCON-Z的H阁。华人民共和国家标准配合饲料中T-2毒素的测定薄层色谱法GB/T 838 1. 4-2005 国中养中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销峰印张O.5 字数7千字2006年1月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2006年1月第一版定价8.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533铃书号:155066 1-26927
