1、ICS 65. 120 B 46 道国中华人民共和国国家标准GB/T 8381. 5-2005 饲料中北里霉素的测定Determination of kitasamycin in feed 2005-09-05发布2006-02-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检瘦总局也t中国国家标准化管理委员会保叩GB/T 8381.5-2005 前本标准参考了国内外有关北里霉素生产、检验等资料，根据我国饲料工业的实际情况制定。本标准的附录A为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。本标准由辽宁省兽药饲料监察所负责起草，吉林省兽药监察所和国家饲料监督检验
2、测试中心(北京)参加起草。本标准主要起草人E陈莹莹、曹东、董永亮、刘雪红、曲韵坤、战石、肖勇、李广生、刘同民、杨曙明。I GBjT 8381. 5-2005 饲料中北里霉素的测定1 范围本标准规定了饲料中北里霉素的测定方法。本标准适用于浓缩饲料、配合饲料中北里霉素的鉴别和含量测定。采用本方法鉴别北里霉素的最小含量为2.5mg/峙。采用本方法测定北里霉素定量的叩且一1-_ _._-，.:-咱.2500北里霉素效价单位。2 规范性引用文件的修改单(不包括勘误是否可使用这些文件GB/ T 14.1/ 中华人民共下列术语3.1 北里霉素用微生物与生物活性单在4.1 4.2 4. 3 甲醇。4.4 乙酸
3、乙醋。4.5 4.6 4. 7 4.8 4.9 展开剂1，氯仿-甲醇，95+5。4.10 展开剂2，苯-丙隅，4+3。4.11 10%硫酸乙醇溶液。4.12 甲醇-水，1+1。4.13 盐酸榕液，c(HC)=lmol/L。舔准达成协议的各方研究本标准。4.14 北里霉素标准品榕液，称取50mg北里霉素标准品(4.1) ，精确至0.1mg，置50mL量瓶中，用甲醇(4.3)榕解并稀释成浓度约为1mg/mL的溶液。供薄层鉴别用。4.15 北里霉素标准品贮备液:称取50mg北里霉素标准品，精确至0.1mg，置50mL量瓶中，用甲醇GB/T 8381. 5-2005 榕解并稀释成浓度约为1000 u/
4、mL的溶液。在20C-100C可以保存7天。供含量测定用。5 仪器及设备5. 1 分析天平，感量0.0001 g。5.2 天平，感量0.01go 5.3 旋转蒸发器。5.4 浓缩瓶，容量10mL，底部具0.2mL刻度尾管。5.5 玻璃板，规格20cmX10 cm。5.6 展开槽，立式，规格10cmX5 cmX20 cm。5. 7 薄层涂布器，涂布厚度0.3mm。5.8 微量注射器，25L、50L。5.9 振荡器。5. 10 离心机。5. 11 电热恒温水浴。5. 12 平底双碟:直径约90mm，高16mm-17 mm;符合中华人民共和国兽药典)2000年版一部的要求。5. 13 不锈钢小管z高
5、10.0mm土0.1mm，外径8.0mm士0.1mm，内径6.0mm士0.1mm;符合中华人民共和国兽药典)2000年版一部的要求。5.14 恒温培养箱。5. 15 高压灭菌锅。5. 16 游标卡尺(精度0.02mm)或抑菌圈测量仪。6 试样的制备将按GB/T14699. 1取得的样品，四分法缩分，取约200g，经粉碎，全部过1mm孔筛，混匀，装入磨口瓶中备用。7 鉴别7. 1 原理用pH3的水榕被从试样的乙酸乙醋溶液中提取北里霉素，调节水榕液的pH值到8，再用乙酸乙醋萃取水榕液中的北里霉素，经浓缩、榕剂转换，与标准品同时在硅胶G薄层板上展开，比较两种展开剂条件下二者的Rf值，鉴别试样中是否含
6、有北里霉素。7.2 测定步骤7.2. 1 提取取20g试样(肘，精确至0.01g，到150mL具锥形瓶中，加入20mL乙酸乙醋(4.4)，振摇30min, 过滤，滤渣及容器用10mL乙酸乙醋分四次冲洗，合并滤液于旋转蒸发器(5.3)的蒸发瓶中，在低于600C减压蒸发至约余2mL。7.2.2 净化将浓缩液(7.2.1)转移到125mL分液漏斗中，用3mL乙酸乙醋分2次洗涤蒸发瓶，洗液并入分液漏斗(此时榕液体积以控制在约5mL为宜)。取事先用盐酸溶液(4.7)调节至pH3的水5mL到分液漏斗中，振摇1min，收集下层水提取液，反复提取3次，合并水提取液。用30mL正己皖(4.5)分3次洗涤水提取液
7、，弃去正己皖。用1mol/L氢氧化饷榕液(4.8)调节水提取液至pH8，再用30mL乙酸乙醋分3次同上述酸性水提取方法提取，小心分出上层乙酸乙醋提取液于蒸发瓶中，在低于600C减压蒸干。GB/T 8381.5-2005 7.2.3 试样溶液的制备用5mL甲醇分3次溶解残渣(7.2.2)，将榕液转移到浓缩瓶(5.4)中，于600C水浴中蒸干，冷却至室温后加入0.1mL甲醇溶解残渣留作薄层层析用。7.2.4 测定7.2.4. 1 薄层额的制备取4g硅胶G(4.的，加水约11mL，研磨2min至呈粘稠状，铺成三块薄层板(5.日，置室温干燥后，于1050C活化2h3 h，贮干燥器中备用。24h内使用。
8、7.2.4.2 点样取两块薄层板(7.2.4.1)，在每块薄层板距下端2cm处作为基线点样。每块板各点三个样点:10L北里霉素标准品溶液(4.14)、5L试样榕液(7.2.3)和5L北里霉素标准品榕液、10L试样榕液，放置30min。各点间距离应不小于2cmo 7.2.4.3 展开在两个展开槽内分别加人展开剂1(4.9)和展开剂2(4.10)各10mL，将点好样的两块薄层板分别置展开剂中纵展13cm，取出通风挥干。7.2.4.4 显影在展开后的薄层板上喷上一层均匀、湿度合适的10%硫酸乙醇溶液(4.11)，于通风处放置显色，也可以在1000C流通空气中加热，加速显色。7.3 观察与判定比较薄层
9、板上各斑点的位置以及颜色，判定方法如下:一一在两块薄层板上，试样榕液在与标准品榕液主斑点(面积最大的、颜色最深的斑点)对应处均无斑点出现，且混合加样点的斑点颜色比标准品溶液斑点浅，判定试样中北里霉素阴性;一一两块薄层板中，其中一块板上的试样溶液在与标准品溶液斑点对应处无斑点出现，而另一块板出现斑点，判定试样中北里霉素阴性;一一在两块薄层板上，如果试样溶液在与标准品溶液斑点对应处均出现斑点，混合加样点只显现一个斑点且斑点的位置及颜色与标准品溶液斑点相同，可能判定北里霉素阳性，继续以下含量测定。8 含量测定8. 1 原理在酸性加热条件下，试样中的北里霉素被钝化，失去生物活性，用该钝化液稀择标准品溶
10、液，使与未经钝化的试样榕液处相同背景，以抵消杂质的干扰，用微生物标准曲线法测定含量。8.2 测定步骤8.2.1 菌悬液的制备取藤黄微球菌(4.2)的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基(第A.4章)的培养瓶中，在260C270C培养24h，或采用适当方法制备的菌斜面。用0.9%灭菌氯化嗣溶液(第A.1章)将菌苔洗下，置40C冰箱保存(不宜超过两周)。8.2.2 双醋的制备取平板培养基(第A.5章)加热融化，冷却至500C土lOC，加入适量菌悬液(8.2.1)(以参考浓度标准工作液所至抑菌圈直径在15mm:l:1. 5 mm为宜)，必要时，每100mL培养基中可加入50%葡萄糖溶液(第A
11、.3章)2mL，摇匀。每个双碟(5.12)加入7mL，均匀摊布，放置水平台上冷却，待培养基凝固后，将双碟倒置于40C，玲藏1h以上。临用前取出，在每个双碟内半径为2.8cm圆周上等距离放置6个不锈钢小管(5.13)。3 GB/T 8381. 5-2005 8.2.3 钝化液的制备量取制备试样挥军液(8.2.5)的上清液20mL到500mL具塞锥形瓶中，加1mol/L盐酸溶液(4.13) 1 mL，摇匀，密塞，在100.C水浴中加热1h，冷却至室温后，用1mol/L氢氧化铀溶液调节pH至7.8 8.0，加5mL甲醇，用氯化铀磷酸盐缓冲液(第A.2章)稀释到与试样榕液相同的浓度。8.2.4 标准曲
12、线的制备8.2.4. 1 标准工作溶液量取北里霉素标准贮备液(4.1日，用钝化液(8.2.3)稀释便成0.05u/mL、0.10u/mL、0.20u/mL、0.40 u/mL浓度的标准工作溶液。以0.10u/mL为参考浓度标准工作溶液。8.2.4.2 培养取当天制备好的双碟(8.2.2川同与分为4组，标准工作溶液而1iIIZ.4.1)每一浓度为一组。每一个双碟的6个不锈钢小管中，间fLK3个滴国S鸣惊匮附n喃益液，另列、个滴加该组标准工作溶液，每8.2.6 测定取与标准曲线同时式中:修该该溶一-一组ABAM 1度离浓至的移国民局黠-m里咛ALvulip-4 切中-水(4.12)，振摇至适当浓度
13、(使溶液9 判定与结果计算9.1 判定一一试样溶液不产生抑菌圈，判定北里霉素阴性;一一试样溶液产生抑菌圈，判定北里霉素阳性并计算含量。9.2 结果计算用回归方程求出标准工作溶液参考浓度对应的抑菌圈数值作为修正值，按式(1)校正试样溶液抑菌圈读数的平均值，再用回归方程求出试样溶液中北里霉素的实测浓度(c)。试样中北里霉素的含量按式(2)计算:w=三羊旦X1 000 拧l ( 2 ) 4 GB/T 8381.5-2005 式中zw-一试样中北里霉素的含量，单位为北里霉素效价单位每千克(u/kg);C一一试样溶液中北里霉素的实测浓度，单位为北里霉素效价单位每毫升(u/mL); n-一一试样的稀释倍数
14、:m一一试样质量，单位为克(g)。测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留至整数位。10 重复性同一操作者对同一试样同时两次平行测定所得结果的相对偏差不大于20%。5 GB/T 8381. 5-2005 附录A(规范性附录)溶班及培养基的配置A.1 0.9%灭菌氯化铀溶液取氯化铀9g.加水使成1000mL.滤过，分装.100.C灭菌30min。A.2 氯化铀磷酸盐缓冲液(pH7.8)取氯化铀10g、磷酸氢二饵5.59g与磷酸二氢御0.41g.加水使成1000mL.捕、过，分装.1l5.C灭菌30min。A.3 50%葡萄糖溶液取葡萄糖50g，加水使成100mL.谑过，分装.100.C灭菌30m
15、in。A.4 营养琼脂培养基陈10g 氯化饷5 g 琼脂15 g20 g 肉浸液1000 mL 除琼脂外，棍合上述成分，调节pH值使比最终的pH值略高O.20. 4.加入琼脂，加热榕化后滤过，调节pH值使灭菌后为7.27. 4.分装.1l5C灭菌30min.趁热斜放使凝固成斜面。A.5 平板培养基陈6g 牛肉浸出粉1. 5g 酵母漫出粉6 g 葡萄糖1 g 琼脂15 g20 g 水1000 mL 除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节pH值使比最终的pH值略高O.20. 4.加入琼脂，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.88. O.分装.1l5.C灭菌30min。培养基
16、可以采用相同成分的抗生素微生物检定培养基11(中华人民共和国兽药典2000年版一部)的干燥培养基代替，临用时，照使用说明配制和灭菌。6 的CON-山区的H国。国华人民共和国家标准饲料中北里霉素的测定GB/T 838 1. 5-2005 中铃中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销 印张0.75字数12千字2006年1月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2006年1月第一版* 定价10.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533书号I155066. 1-26926 GB/T 8381. 5-2005
