1、ICS 67040X 04中华人民共和国a萤国家标准肉与肉制品 氯霉素含量的测定Meat and meat products-Determination of chloramphenicol content2009-04-08发布 2009050 1实施宰瞀鹞鬻瓣訾糌瞥翼发布中国国家标准化管理委员会仅1。刖 置GBT 9695322009本标准制定过程中参考了“欧盟食品分析方法CY36”。本标准的附录A为资料性附录。本标准由全国肉禽蛋制品标准化技术委员会提出并归口。本标准起草单位：中国肉类食品综合研究中心、中国商业联合会商业标准中心、武汉市疾病预防控制中心、江阴市产品质量监督所、厦门市疾病预防
2、控制中心。本标准主要起草人：宋永青、赵榕、梁高道、郭文萍、吴东雷、骆和东、靳晓蕾、刘振宇。肉与肉制品 氯霉素含量的测定GBT 96953220091范围本标准规定了畜禽肉中氯霉素的测定方法。本标准适用于畜禽肉中氯霉素的测定。本标准检出限：气相色谱一质谱法，检出限为02 btgkg；酶联免疫法为005 tzgkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过GBT 9695本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。
3、GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682 2008，ISO 3696：1987，MOD)GBT 969519肉与肉制品取样方法3气相色谱一质谱法(确证法)31原理样品中氯霉素用乙酸乙酯提取，脂肪用正己烷去除，经C，。净化，BsTFA+TMCS(99+1)衍生后，用NCI源选择mz为466的特征离子为目标离子，在SIM模式下进行GCMS测定。32试剂和材料若无特别说明，所用试剂均为分析纯，所用水应符合GBT 6682的要求。321氯霉素：标准品，纯度99。322甲醇：色谱纯。323三氯甲烷。324正己烷：色谱纯。325乙酸乙酯。326无水硫酸钠。327氯化钠。328 N、口
4、双三甲基硅烷三氟乙酰胺(BSTFA)。329三甲基氯硅烷(TMCS)。3210丙酮：色谱纯。3211甲苯。3212 甲醇溶液：甲醇+水一2+8。3213氯化钠溶液(40 gL)：称取400 g氯化钠(3277)，用水溶解，定容至100 mL。3214甲醇一氯化钠溶液：量取甲醇溶液(3212)20mL、氯化钠溶液(3213)80mL，混匀。3215混合衍生剂：N、口双三甲基硅烷三氟乙酰胺+三甲基氯硅烷一99+1。3216氯霉素标准储备溶液(F01 mgmL)：称取氯霉素标准品001 g(精确至0000 1 g)，用丙酮溶解并定容至100 mL。储备液贮存在4冰箱中，可使用两个月。3217氯霉素标
5、准工作溶液：根据试验需要，用丙酮(2210)稀释标准储备溶液(2217)，配成适当浓度的标准工作溶液。GBT 969532200933仪器设备实验室常规设备及下列仪器。331 气相色谱一质谱联用仪(GC-MS)。332分析天平：可准确称重至0000 1 g。333分析天平：可准确称重至001 g。334离心机：5 500 rmin。335涡旋仪。336固相萃取装置。337旋转蒸发仪。338均质器。339振荡器。3310机械设备：用于试样的均质。包括：绞肉机、斩拌机等肉类组织粉碎机。3311氮吹仪。3312具塞离心管：50 mL、10 mL。3313 C-8固相萃取柱或相当者：200 mg，3
6、mL。34分析步骤341试样液制备3411试样的制备按GBT 969519规定的方法取样。至少取有代表性的试样200 g，使用适当的机械设备(3310)将试样均质。均质后的试样尽快分析，否则，应密封低温贮存，防止试样变质或成分发生变化。贮存的试样在启用时，应重新混匀。3412提取称取10 g样品(精确至001 g)置于50 mL具塞离心管中，加入少量无水硫酸钠和30 mL乙酸乙酯均质1 mln，以5 000 rmin离心5 rain后，用吸管吸出上层乙酸乙酯于浓缩瓶中，残渣再加入乙酸乙酯15 mL重复提取样品，合并提取液。提取液在50水浴中旋转蒸发，除去乙酸乙酯，加入1 mL甲醇一氯化钠溶液(
7、3214)和4 mL正己烷，充分振摇后，转移至10 mL具塞离心管中，用1 mL甲醇一氯化钠溶液(3214)清洗浓缩瓶，合并清洗液于10 mL具塞离心管中。涡旋05 rain，经3 000 rmin离心3 rain后，用吸管吸去正己烷，加入4 mL正己烷重复上述操作。然后在离心管中加入4 mL乙酸乙酯，涡旋1rain，经3 000 rrain离心3rain后，用吸管吸出乙酸乙酯，加入4mL乙酸乙酯重复上述操作，合并乙酸乙酯于浓缩瓶中，在50水浴中旋转浓缩至近于，用5 mL水溶解残渣。3413净化依次用5 mL甲醇、5 mL三氯甲烷、5 mL甲醇、5 mL水活化C。固相萃取柱(3314)，然后加
8、入上述步骤得到的提取液，加5mL甲醇+水(3212)淋洗色谱柱，用25mL甲醇洗脱于浓缩瓶中，洗脱液在50下浓缩至近干。用100 pL甲醇溶解残渣，并转移至10 mL具塞离心管中，再用甲醇冲洗浓缩瓶，合并洗液，于50下用氮气吹干。3414衍生化于吹于的试样残渣中加入100 pL甲苯和100 pL混合衍生剂(3215)，盖紧塞后，涡旋混匀1 rain，60下反应30 min，然后在50下用氮气吹干，加入1 mL正己烷溶解残渣。342标准工作液制备配制好的标准工作液按3414步骤进行操作。343空白液制备除不称取试样外，均按341步骤进行操作。2GBT 9695322009344测定3441气相色
9、谱一质谱法测定条件色谱柱：DB-5MS(30 mX025 mmX025,urn)石英毛细管柱或相当者；载气：氦气，纯度99999；流速：165 mLmin；进样口温度：250；进样量：1,uL；进样方式：无分流(保持1 min)进样；柱温程序：初始55，保持1 min，以25*Crain速度升至280，保持6 min；NCI源：70 eV；离子源温度：150；接口温度：280；溶剂延迟：7 min；反应气：甲烷，纯度9999选择离子检测：保留时间min 目标物 检测离子m=1258 CAPTMS 466，468，376，3783442定性测定进行样品测定时，如果检出的色谱峰保留时间与标准样品相
10、一致，并且在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的离子均出现，而且所选择的离子比与标准样品衍生物的离子比相一致(各相关离子比在相关标准品的10之内)，则可判断样品中存在氯霉素。3443定量测定吸取1 pL衍生的试样液、标准液或空白液注入气相色谱一质谱联用仪中，以mz 466为定量离子，标准工作液中氯霉素的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。根据试样液的峰面积，从标准曲线上查出溶液中对应的氯霉素浓度值。用标准工作曲线对试样进行定量，样品溶液中氯霉素衍生物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下，氯霉素衍生物的参考保留时间为1258 min。氯霉素标准物质衍生物总离子流图和质谱图以
11、及氯霉素标准物质衍生物选择离子质谱图参见附录A中的图A1、图A2、图A3。345平行试验按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。35结果计算按式(1)计算样品中氯霉素的含量： x一虻杀铲UmX l。式中：x试样中氯霉素的含量，单位为微克每千克Ogkg)；c从标准工作曲线上查得试样液中氯霉素的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；Co从标准工作曲线上查得空白液中氯霉素的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；y试样定容体积，单位为毫升(mL)；m称取试样的质量，单位为克(g)。结果取算术平均值，保留三位有效数字。36精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10。GBT
12、969532-20094酶联免疫法(ELISA筛选法)41原理采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上包被偶联抗原，样本中残留的氯霉素和微孔条上包被的偶联抗原竞争抗氯霉素抗体，加入酶标二抗后，加入底物显色，样本吸光值与其残留物氯霉素的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中氯霉素的含量。42试剂若无特别说明，所用试剂均为分析纯，所用水应符合GBT 6682的要求。421乙酸乙酯。422正己烷。423氯霉素酶联免疫试剂盒：2-8冰箱中保存。注：试剂盒应选用国家有关行政管理部门备案的生产商的合格产品。4231酶标板：8孔12条，包被有偶联抗原。4232氯霉素系列标准液
13、：0 tlgL、005 FgL、015 bgL、045 pgL、135 FgL、405 btgL。4233酶标二抗。4234抗体工作液。4235底物液(A液)。4236底物液(B液)。4237终止液。4238洗涤液(浓缩液)。4239复溶液(浓缩液)。42310复溶工作液：将浓缩复溶液20 mL用水稀释至40 mL。42311洗涤工作液：将浓缩洗涤液40 mL用水稀释至800 mL。43仪器设备实验室常规设备及下列仪器。431酶标仪：配备450 nm、630 nm滤光片。432微量移液器：单道20#L200 btL、100zL1 000 pL，多道250zL。433恒温箱。434离心管：50
14、mL。44分析步骤441样本制备样本用均质器均质后，称取30 g+005 g至50 mL离心管中，加入6 mL乙酸乙酯(421)，用振荡器振荡10 min，于室温(2025)、5 500 rrain离心10 rain，移取4 mL上层有机相至10 mL干净的玻璃试管中，于5060水浴氮气流下吹干，加入1 mL正己烷(422)，用涡旋仪涡动30 s，再加1 mL复溶工作液(42310)，用涡旋仪涡动1 rain，于室温(2025)、5 500 rrain离心15 mi“；除去上层有机相，取下层100 pL用于分析。稀释倍数为05倍。442空白对照样本取空白试样，按441步骤进行操作。443测定步
15、骤4431微孔板及试剂的准备：从冷藏环境中取出需要数量的微孔板和其他所需试剂，置于室温(20-25)平衡30rain以上，并将不用的微孔板放入自封袋中，保存于28。4432编号：将样本、标准品、空白对照样本对应微孔按序编号，记录样本孔、标准孔和空白样本孔所在的位置。注意所有试剂及样本溶液使用前均应摇匀。4GBT 96953220094433加样：加100 pL标准品、样本、空白样本到对应的微孔中，再加入抗体工作液(3234)50 pL孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25避光环境中反应30 min。4434洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液(32311)250 tL孔，充分洗涤
16、4次5次，每次间隔10 s，用吸水纸拍干。4435加酶标二抗：加入酶标二抗(3233)100 pL孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25避光环境中30 rain，取出重复洗板步骤(354)。4436显色：加入底物液A液(3235)50 pL孔，再加底物液B液(3236)50 pL孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25避光环境反应15 min。4437测定：加入终止液(3237)50 pL孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪450 nm及630 nm双波长检测，测定每孔的吸光度值。45结果计算按式(2)计算百分吸光度值：相对吸光度值一瓦B100式中：B标准溶液或样本溶液的平均吸光度值；3。oppb标准溶
17、液的平均吸光度值。将式(2)计算得到的相对吸光度值()对应氯霉素(pgL)的自然对数，作半对数坐标校正曲线，根据样本的相对吸光度值，从校正曲线上查出溶液中对应的氯霉素浓度值。按式(3)计算样品中氯霉素的含量：Y一!垒二垒!丕 一m1 000式中：x试样中氯霉素的含量，单位为微克每千克(,ugkg)；A试样的相对吸光度值()对应的氯霉素含量，单位为微克每升(pgL)；A。空白样本的相对吸光度值()对应的氯霉素含量，单位为微克每升(,ugL)；，试样稀释倍数；m称取试样的质量，单位为克(g)。结果保留三位有效数字。阳性结果应经过气相色谱一质谱法确证。46精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20。GBT 9695322009附录A(资料性附录)标准物质衍生物总离子流图、质谱图和选择离子质谱图A1 氯霉素标准物质衍生物的总离子流，见图A1。(x lOO ooo)图A1A2氯霉素标准物质衍生物的质谱图，见图A2。466503232325 1378 ；05322 3啡39，4430 449473216 7“I342 L133 151 268300 350图A2500 mzA3氯霉素标准物质衍生物的选择离子质谱图，见图A3。GBT 969532-2009466376图A3
