1、ICS 65.120 B 20 NY 中华人民共和国农业行业标准NYjT 726一2003饲料中杆菌肤铸的测定高效液相色谱法2003-12-01发布Determination of bacitracin zinc in feeds High performance liquid chromatography 常叫时叫部发布2004-03-01实施NY/T 726-2003 前言本标准参考了AOAC65、1168(1982)(预混料中杆菌肤镑的测定方法和有关国内外文献，并结合我国的实际情况制定的。本标准的附录A是规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归
2、口。本标准由国家饲料质量监督检验中心(北京负责起草。本标准主要起草人:高生、饶正华、范理、李丽蓓、杨曙明。1 范围饲料中杆菌肤铸的测定高效液相色谱法本标准规定了以液相色谱仪测定饲料中杆菌肤伴的方法。本标准适用于猪、鸡添加剂预混料中杆菌肤钵含量的测定。2 规范性引用文件NY!T 726-2003 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注目期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法G
3、B/T 14699. 1 饲料采样方法3 方法原理添加剂预混料中的杆菌肤钵可用酸化的有机溶剂体系提取，离心，取上清液用于液相色i曾分析。4 试剂和材料以下试剂除特殊标明均为分析纯，水符合GB/T6682二级用水的规定。4.1 磷酸盐缓冲液:pH6.0，称取1.5日磷酸氢二饵和8.5g磷酸二氢饵，溶解于1L水中。4.2 磷酸盐EDTA缓冲液:pH4.5，称取13.6g磷酸二氢仰和2.5g乙二胶四乙酸二锅溶解于1L 水中。4.3 杆菌肤铸标准液4.3.1 标准贮备液的配制z准确称取杆菌肤镑标准品150.0mg，用提取溶液溶解，并定容100mL.此溶液杆菌肤钵浓度为1500 mg/L, 4.3.2
4、中间液.吸取标准贮备液(4.3.1)10mL.用提取溶液定容至50mL。该溶液杆菌肤镑的浓度为300 mg/L, 4.3.3 工作液吸取中间液(4.3.2)0.20mL、1.0 mL、5.0mL，用提取溶液定容至10mL该溶液杆菌肤伴的浓度分别为6mg/L、30mg/L、150mg/L, 4.4 溶剂系统:按表1配制。各熔剂标识的体积量取各溶剂置于100mL容量瓶中，用水运容至刻度。表1溶剂系统表体积/mL溶剂A溶液B溶液提取榕液乙脯。40 28 甲醇。12 28 磷酸盐EDTA缓冲液20 20 。磷酸盐缓冲液。3 浓磷酸。1. 2 NY/T 726-2003 5 仪器与设备5.1 分析天平z
5、感量。001g，感量0.0001 g. 5.2 超声波水浴。5.3 离心机，4000 r/min. 5.4 高效液相色谱仪:配有紫外检测器和2.5X150 mm C18色谱柱。6 样晶的制备根据GB/T14699.1取具代表性的饲料样品，粉碎通过0.45mm孔径筛，充分混匀后装入磨口瓶中备用。7 分析步骤7.1 提取称取试样2.000g.准确加入提取溶液10mL.充分摇动使试样与提取溶液完全混合，置超声波水浴中超声提取15min，其间不时用手摇动，取上层液于离心机上4000r/min.离心5mino直接取上清液用于高效液相色谱测定。7.2 测定7.2.1 液相色谱条件a) 色谱柱，2.5X 1
6、50 mm，4mC18色谱柱。b) 流动相z取溶剂系统表1A溶液，B溶液为41+59混合，用浓度为c(NaOH)=lmol/L氢氧化纳溶液调pH为6.8.c) 检测器:可调波长检测器，检测波长为254nm. d) 进样量，20L.7.2.2 定性定量方法在上述条件下，以杆菌肤镑三个主要活性成分(见附录A)的峰保留时间，比较进行定性确认，以三个主要活性成分的峰面积加和值与相近浓度的杆菌肤铸标准液的峰面积加和值比较进行定量计算。8 分析结果的表述以质量分数表示的试样中杆菌肤镑的含量按式。)计算z式中=Z A-ma V 一一A. .m.Y; z 以质量分数表示的试样中杆菌肤镑的含量，单位为毫克每千克(mg/kg), A 试样中杆菌肤僻的加和峰值gA，-标准杆菌肤镑的加和峰值;m , 标准杆菌肤镑的进祥质量，单位为纳克(ng), Y, 注入HPLC的体积，单位为微升(L)，m一一称取试样的质量，单位为克(g)，V一试样的定容体积，单位为毫升(mL)。9 允许差两次平行检验结果的相对偏差小于等于10%。( 1 ) NY /T 726-2003 附录A(规范性附录)杆菌肤铸标准固谱100.00 。LFLF同ti-v75.00 50. 25.00 25.00 18.75 12.50 6.25 0.00 Min. 0.00 杆商肤铸标准圈谱图A.l
