1、ICS .020 c59 备案号:25518-2009认TS中华人民共和国卫生行业标准ws 295- 2008 流行性脑脊髓膜炎诊断标准Diagnostic criteria for epidemic cerebrospinal meningitis 2008-12-11发布2009-06-15实施中华人民共和卫国卫生部发布ws 295-2008 目U吕根据中华人民共和国传染病防治法制定本标准。按照国家质检总局、国家标ffl委公告(2005年第146号),GB 16884-1997(流行性脑脊髓膜炎诊断标准及处理原则自本标准实施之门起废止。本标准的附录A为规范性附次.附录B为资料性附求。本标准
2、由U宅部传染病标准专业委员会提出.本标准由中华人民共和国E牛部批准。本标准起草单位:北京地坛医院、IFI国疾病预防控制中心传染病预防控制所。本标准主要起草人=李兴旺、邵祝军、蒋荣猛、李胖、李军宏。ws 295-2008 流行性脑脊髓膜炎诊断标准1 范围本标准规定了流行性国脊髓鸥庚的诊却if/多元脑脏剌激.(JE.脑脊泊检查多元异常也!J)脑膜脑炎型:除有高远、头痛再!岖nl外，可迅i主陷入昏迷，颜萦抽捕，锥体束征阳ft.血压持续升高，球纣iJj.k肿-部分患者H现脸It(小脑)在JJ迹?在i、枕骨大孔痛)，表现为反倒盹孔不非人，对光反应迟钝或消失?可出现呼啦不用则.快俊探浅不一或骤序，肢体肌张
3、力肿强咛c)混合型:同时具备休克型和脑膜nl炎型的临床表现，此型最为凶险.顶.IJ.iX二，病此事岗2.2. 3.3 轻型|临床表现为低热、轻微头痛、日因脑等上呼吸道感染症状;皮肤茹膜可有少ii细小:IllfiL.a.、U亦可有的棋剌激征。黯脊被可有轻度炎症改变。2. 3 实验室检查ws 295-2008 2. 3. 1 末梢血象内细胞总豆豆、中性控细胞计数明显到尚.2. 3.2 脑脊渣外m呈i1i=i血米汤样或服样.压力增高:白细!血敬明增高，并以多核细胞增高为主;槽&.氧化物明显跟少，组Ul量升高=2.3. 3 病原学2. 3.3. 1 J.应点l览)组织液、脑脊液涂片险测.-f伍中性柑细
4、胞内见到草兰阴性肾形双1;,rJ. 2. 3. 3. 2 脑臂液、血地培养脑膜炎奈瑟闺阳性a2. 3. 3. 3脑仰、血液瞄蟆炎奈瑟菌辜蝉霄股市附酬壮2. 3. 4 血清学2.3.4. 1 :J.、住期的背班、血液晨2. 3. 4. 2 恢复期血清流伊:3 诊断原则4诊断4. 1 带菌者以上到tfZ.似及I!lit1弩断气菌阳件;或自膜炎奈瑟菌特异性也酸序段检W阳性。5 鉴别诊断下:和!其他细茧所致的膳膜- l:j，可热惊融等疾病鉴别。2 A. 1 脑膜炎奈瑟菌分离培养A.1.3 血液标采取忠者氨E取1(11.液O.1mL日进行观媒.如，tl现A. 1.4 脑膜炎京4U I 本剧在血席俨也色似
5、露珠状、卡透而死亡，此前在65荒膜及细胞瞧，此古霉素、制远菌素等咖啡豆形成球菌JA. 1. 6 脑膜炎奈瑟菌生化特征ws 295-2008 附录A(规范性附录)脑膜炎奈瑟菌实验室检泪1方法抗件:东治疗前，在深靠血?夜标本过程中不应使用抗凝剂。;2LI即注人30mL增菌用的葡萄树肉?易角瓶内，并同时一轼花瑞环画370C培养，24h-72h，蝠菌捕的葡萄糖肉汤每绝大多数:m商株分解葡萄糖和企芽黯，产酸不产气。不分解荒塘、果黯和乳糖.过氧化酶和氧化酶阳性.A.2 脑膜炎奈瑟菌血清学分群A. 2.1 试验方法采用玻片凝集试验方法。Nm诊断血消包括多价1(包含A、B、C、D群、多价(包含Y、H、29E)
6、、多价皿(包含W135、X，I、K群及各群单价血清，共计13种。但世界卫生组织(WHO)已不推荐D3 ws 295-2008 挂羊作为常凶险洲的闲情群内A. 2. 2 实验操作用乙1撩挣-1J占主敲片.用蜡草或Jtf也记号笔将坡政Jt分为二三个部分?句个部分lmmv-l: mrn 在每个部分酌近底部处加1l/.t.LO. ,) 甜可1生理盘水，J目无在H在种环、忏、尤菌站w或牙签)J，HAP 1采取细菌的拌物，(I;1.理盐水中.将培养物制戚用于制试的路哺乳;佳状的悬液.在每个市)5t (j _j.1昂棚上所选的JflL市各lOJ.L以及101L生理盐水或PBS(二者都pJ以)。在亮元下或黑色
7、背黑:t-，将抗血泊或生理盐水与各内的墙养菌忌、准混合，摆动玻片1ml1 2min BJftJJ可能会因为血消的制j富汗不同1M有所差异A. 2. 3 实验结果舶读取培养在J应该l!与种抗血泪;在集.币1与生理盐水或PB.s在会发生时是反应如果在生理盐水中延应i觅明f;J商有自晓性;和几玛拉;血i育程枭而无自程现象.说明培养liiJ二哩槌的;相任何种HL.ill!.或生理盐水都不能发生提集.说明商株为不能分群菌林。这样的结果在新鲜分离株中很少发尘.Ii确实会偶尔发+，础l清军IIfk理盐水/PBSJ应在IDC冰箱中储存备用，A.3 标本及疑似菌株采用聚合运链式反应(P口)辅助鉴定对不能用血rl
8、学分胖的眩黯炎奈瑟茵疑f甫株或无法进行脑;!走去瑟茵分离培择的脑脊液、血液、血j标本可采阳rCR方必进行D:A扩增辅助检测鉴定-A. 3. 1 目的基因略j在眼转移wJJj_t:肉(Sld毕囡):可以作为PCR扩增的日8!Jy.-段来区分/气、B、C、W135、Y等五个常见流呐nr请辟.Crg.飞及。rf-2基因可作为流植条惹菌属的特异性基剧.A. 3. 2 寡聚核甘酸引物序列1) crg八F:5 -gctggcgrrgctggcaaC1ilaat tc-3 , R: 5 -(t tngcagatrgcggcgt.gccgr-3 2) Ur :2 (A) F: 5 -cgcaalaggtgta
9、tatattcttcc-3 , R: 5 -cgtaatagtttcglutgccttctl斗3)拍aD(B)F:子ggatcatttcagtgtllll二cacca-3, R: 5-gcatgctggag毡aataagcattaa-3 .;) Sl.,) (巳)F:了lC.atlgagl.l tgcgaal冉g凡aggt-了，R: :; -caalcacglHtgcn:a.angac:-3 5) SaD ( Y)F : .1 ctcaaagcgaaggctttgg-tla-3 , R: S-ct!aagcg1tncattataattgctaa-3 6) SiaD(W I. ) F: 5.ca
10、gaaagtgaz-ggalttccat.a 3 , R: S cacaaccattttcattaragu3cigt-3 A. 3. 3 样品处理可采川同前市仰的DNA提取试剂盒提取样品DNA。也可采取直接煮沸方法，将样品羔;v30min同窝，心，取ki占液作为扩:曾样品.A. 3. 4 扩增及检测条件出2飞30s.55飞lOs.72飞305.3;个1环反应产物用J.5%2%靠腊黯提I毡剖，电FEf V 1cm. A.4 胶乳j疑集检测已有dJ售的试齐IJ盒，严格遵照制;也荫的操作说明进行操作。为了获得最佳的结果，CSF样本的1-.1宵庇尽快监测i如果不能立即检测.样本l创冷藏(2.C80C】
11、几个小UJ.!iX:在一20.C(东布吏伏的时间3备用试jfIJJ句i去t.C-8飞保存、不附叶;存A. 4.1 患者标本的处理方法A. 4.1.1 CSFliJ心忡。OOrmi n . 20mi肘，取上捕，沉淀部分作细菌屠养;A. 4. 1. 2 急性期1(11液(2mL)，分离血消，置56.C将其灭活30minjA. 4. 2 结果判断A. 4. 2.1 按照说明书操作进订，在亮光卡.不需要扩大倍撤出取。ws 295-2008 A.4.2.2 阴性反应:悬被仍均属)1出现轻攒的浑浊。A.4.2.3 阳性反应:乳胶颗粒2min内凝集成吁见团块)。A.5 酶联免在吸附试验(ELISA)应用EL
12、lS:I接法洒患者2.性期和恢复期血清中的扰你水r，也可以应用于健康在血清抗体的拥定.严悟遵照制造商的操作说明进行模作A.6 杀茵力试验应用微量杀雨jJ试验(TTC法)制定居、古急性j目和恢复用j血清中到im的杀菌抗体水平。此方法也可用于健康人群的血清抗体洲足，为检测忠在血清抗体血清的标准实验A.6. 1 目标靶菌应选择对补体的自然杀菌作用具有耐受性，但对杀菌抗体反应敏感的脑膜炎奈瑟菌IB株2A. 6. 2 稀释液灭菌院酸盐绩lllt盐水、pH.I.使用时每lOOmL稀怦戒hD)(;舌小兔血前lmL，刀-llli:;至王OO，u.g，多枯菌B2500单也s配就的稀梓i在盛于小瓶中.置rc备JI
13、l 2 f司pA. 6. 3 滴定握、补体及琼脂j豆部呈U形的96孔带盖有机破璃，地滴饭一般采用幼龄兔或成盼兔血洁中筛边的兔补体，Bl凶测定要求它们不能具有自然杀靶|苟的活性，但加有已知阳性在考血清时i.产生较高杀向抗体滴度。使用迅化之i苯基四氮I珠脂培养基(TTC琼脂)。A. 6. 4 阳性参考血清同趴dl1免在兔:M备的珍断血清.未加阳腐剂.经脱试i回定J:t杀菌忧i卒i商度较高1: 3 200以上) A. 6. 5 杀菌抗体测定步骤A. 6.5.1 靶菌液的制备:博A、B或Cj昨:-.Jm曲纯培养物制成轻度说浊的均匀菌悬液，其光密度值相当于0.1。以茵洁的虽终浓度为4000cfu/mL。
14、稀释好的靶茵悬撒在lh内用完。:室温较高，可将菌液管lt冰附中，以防靶菌迅j事死亡。A. 6.5.2 杀菌抗体的现IJ定:先在磁i离板每孔内川25L的珩择液，用哆液器从每排第一孔内加25L经560C30min 反活的待栓血清.吹吸马次Hllx_J丘喷出25L豆，;一孔，如此作连续借比南辞至最后-孔。从fk温冰箱内取出补体，于37C温水中揣动将其速洁，每孔加2句l忖每孔加一滴稀ff成合适浓度的理茵茵擅.微滴板宜最也提高器上叶速撮高5min，肖在37tf养2Smin，取出后重复上述振荡c每手LM2i内已溶化并玲垒:45。巳左右的TTC13(脂民.微滴板置5h二氧化碳环境37C培养15h-2h后现架
15、结果。A. 6. 5. 3 实验对照阳性参考血717对照;4孔补体赳照(稀梓波、补体、菌液各一滴，检在补体自然杀凶活性);4孔细菌生长时熙、(稀释液、灭括补体和理茵菌战各i汹j)，每次检测时至少每5块微i南极中应有一组上述三苟对照试验。往各孔漓完靶芮:液之后.应将该商液两i由分别滴如!至u一个巧克)J色琼脂平皿的一端.沿着划好的两条线倾斜干比.于3rc.S 二氧化5块环境的同盯岛养.次门检查每滴靶菌的菌落数及其纯度A . 6. 5. 4 结果判断先检查上述三种对照试验的结果，补体的和细菌生长对照的各孔应出现众多的红色点状小菌落;阳性参考血清应达到原来确定的杀菌滴度。若所试各孔中红包i氧状商落数
16、口明显地少于补体对照孔或不出现红色点状re藩时，贝IJ判断为杀苗卧性;如果所试孔11的rn落数目接近补体对照孔的一半或更多日J，5 ws 295-2008 则判断为杀菌阴性.根据红色点状茵落数目的多少，以符号h十记录试验结果。若补体及靶菌生长对照各孔的细菌正常生民时，应出现众多红色点状l直落，可记为十+。当所试各孔与其比较，菌落数减少30以下，记为十+. ;减少50%左右记为+;减少70%左右归为+;每孔少于10个菌落则记为士气以缅菌生长_I._及以下者判断为杀菌阳性;以十十及以上者判为杀菌阴性a以出现杀菌阳性的血清最高稀释度为杀前抗体的最高滴度6 ws 295-2008 附录B(资料性附录)
17、病原学、流行病学、样品采集和运送B.1 病原学B. 1. 1 流行性Jj，xj脊髓膜炎的病原附为脑膜炎奈瑟商.俗称脑膜炎双球菌，为肾型或豆型革兰阴性双球菌。在患者刷抒液t:l，多位于中性耕生IUl血肉#曹营典型新业菌的菌株大多带有英膜和菌毛，人工培养后可成卵困j岳戚球形，排列不规叫B. 1. 2 脑盹炎奈军菌的主要班乒现皮肤疯rY顶和做循珊贯，._.B. 2.3 人群易感人群普遍易挝长rm逐渐降低易亏面括号点，7%表现为上呼B. 2. 4 流行特征B. 2. 4.1 地区分布全球均有流脑发病。A、部辑:走为B群或C群，近年在非制发生Wl病例发生。B.2.4.2 周期性在流脑曲曲广泛应用以前曾大
18、约3年5年出现一次小流行，8年lO年11现一次较大革行，流脑茵茵的接种可改变流行的周期性。B. 2.4. 3 季节分布全年皆可发生，以冬春季节发病较多。B.3 流行性脑脊髓膜炎的样品采集和运送实验检出脑膜炎奈瑟菌是流脑的确诊依据，适宜的检测样品为脑脊液、血液、皮肤勃膜挺起点或椒班组织掖、血清及鼻、咽拭子等，脑脊液、血液、皮肤勃膜痕点或按斑组织液中检出脑膜炎奈瑟菌可真接作/ ws 295-2008 为确珍俄据B.3.1 样品采集B. 3. 1. 1 咽拭子用长柄棉拭f采UUJ后壁两侧分泌物，.即接种于!l在A时fL培养基(EPV)或巧克力羊血-，r极，也J将口国拭子放人;剧本双抗增菌管内，增茵8
19、h12h以后分liJ&养。B. 3. 1. 2 脑脊液采集脑脊液lmL3mLo可用O.1 mLO. 5mL直撞接种于巧克力或EPV平板，也可先增菌再进行分离培养。B. 3. 1. 3 血液元商捶作抽取且主热期患者全I阻5mLlOmL，O.1I!lLO. 5mL直接接种EPV平憬，余血立即加于50mL的葡萄幢肉面中增前后再分离地养.采集患者发抽早期丰田恢复期双份血洒，垃测血清中特异性抗体呈l倍或4倍以上升高。B. 3. 1.4 寐点或原斑选患者皮肤|年的耕衅樵点或接到.生理盐水消毒后用针头挑眩，挤出组织坡，用?肖毒后的破片II接取组织撤除jtJ在二染色镜中在回也IJm元菌悔签蘸取组织液先接种于含双抗的葡萄糖增菌肉汤誓 1:1 增茵8h12h后分离陆养或直接接采jlEPV平捏，再涂片*色.按镜检。B. 3.2 样品的处理和运送B. 3. 2.1 样品处理脑膜炎荣立菌比较脆弱，采集样品后.应尽可能地做到)桌边接种，若无可能则应在最短的时间内送至实验室进行接剧埔养cB. 3. 2. 2 旱期采集样品应尽咱也能;在集患者使用抗生素前的平均样品.以提高病原的检出率。B. 3.2. 3 保温运送F.;要炎奈革I边贸I温度较为敏感.温度过低或过高均可导致i直株死亡。在远远样品或培养韧时，应惺J寺样品处于25C-35C之间，切记不能低i晶运送(撞i周抗体的血清标本除外)。8
