1、GB/f 17812-1999 前言饲料中维生素E的测定目前尚无国际标准，本标准是参照瑞士罗氏药品化学有限公司维生素研究部发表的饲料中维生素、类胡萝卡现代分析方法中用高效液相色谱法测定配合饲料、预混合饲料和浓缩维生素中的dl生育酷而制定的。在技术内容上参照该法，在编写格式上依据GB/T 1. 1一1993(标准化工作导则第1单元2标准的起草与表述规则第1部分:标准编写的基本规定和GB/T). 4一1988(标准化工作导则化学分析方法标准编写规定。为了使饲料中维生素E测定方法科学、准确、经济、实用，适合于我国不同实验室大量饲料样品的测定.在参照国外分析方法的基础上增加了反相色谱测定条件。本标准由
2、全国饲料工业标准化技术委员会提出并归口。本标准由国家饲料质量监督检验中心(北京)负责起草。本标准主要起草人:陈必芳、赵小阳、李俊玲。 21:3 1 范围中华人民共和国国家标准饲料中维生素E的测定高效液相色谱法Determination of vitamin E in feeds High-pressure liquid chromatography 本标准规定了饲料中维生素E的测定高效液相包谱法。GB/T 17812 1999 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、复合预混料、维生素预混料中维生素E的测定。检测也图为每千克样品中含维生素E的量在1.1IU (dl生育盼1mg)以上。2 引用标准F J
3、iIJ标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时.所yt版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。GB/T 6682-1992 分析实验室用水规格和试验方法3 方法原理用碱溶液皂化试验样品，去除脂肪.使试样中天然生育盼释放出来并水解，添加的生育盼乙酸睹为游离的生育盼。乙酶提取未皂化的物质，蒸发乙酶，用正己烧溶解残渣。提取物注入高效液相色潜特.用紫外怆测器在280nm处测定，外标法计算维生素Edl一生育盼)含量。4 试剂和材料除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯，水为蒸饱水，色谱用水为去离子水，符合GB/T6682 中用水
4、规定。4. 1 无水乙目击:无过氧化物。4. 1. 1 过氧化物检查方法:用5mL乙磁加1mL 10%碗化饵溶液，振摇1min，如有过氧化物则放出游离串跑，水层呈黄色，或加0.5%淀粉指示液，水层呈蓝色。该乙隧需处理后使用。4.1.2 去除过氧化物的方法:乙隧用5%硫代硫酸纳溶液振摇，静置，分取乙醋层，再用蒸饱水振摇，洗吉普两次.重蒸，弃去首尾5%部分，收集馆出的乙酶，再检查过氧化物，应符合规定。4.2 乙醇04. 3 正己烧:重蒸馅(或光谱纯)。4. 4 1 , !二氧六环。4. 5 甲醇:优级纯。4.6 2，6二叔丁基对甲盼(BHT), 4.7 元水侃酸锅。4.8 氢氧化锦溶液500g/L
5、。国家质量技术监督局1999-08-10批准: 1 2000- 02 01实施G8/T 17812-1999 4.9 抗坏血酸乙醇浴液5g/L，取0.5g抗坏血酸结晶纯品溶解于4mL混热的蒸馈水中.用乙醇稀释至100mL，临用前配制。4.10 维生素E(dl.生育阶)标准溶液4. 10. 1 dl-a-生育盼标准贮备液:准确称取dl生育自由ge品油剂(USP)100.0 mg于1110mL棕色容培瓶中，用正己烧溶解并稀将至刻度，1昆匀，4C保存。该贮备液浓度每毫升含维生素El.0mg. 4.10.2 dl生育盼标准1二作液准确吸取dl-生育盼贮备液(4.10.)，用正己烧(1.:n梭1, 20
6、比例稀释。Af目反相包谱测定，将lmLdl生育附标准贮备液凹入10mL棕色小容量瓶中，J目氮气l吹干.用甲醇(4.5)稀释歪刻度.j昆匀.再按比例稀释。配和J_l作液浓度为待运升含维生素ESO问。4. 11 盼Iil;指示剂乙静j存液，10g/L 4.12 氮气(纯Jl!99. 9%)。5 仪器、设备5. 1 实验室常用设备。5. 2 圆底烧瓶，带回流冷凝器。5.3 恒温水泊或电热套。5. 4 旋转蒸发器。5. 5 超纯水器(或全磨1:1玻璃蒸馆器)。5. 6 高放液相色谱仪.带紫外检测器。6 试样的制备选取信代表性的饲料样品至少500g，四分法缩减至100g，磨碎，全部通过0.28mm孔筛.
7、混匀，装入密闭容器中，避光低温保存备用。7 分析步骤7-1 试验路液的制备7. 1. 1 宅化称取试样配合饲料或浓缩饲料10g，精确至O.001 日，维生素预j昆料或复合预混料15 g，精确至O. (的01gol:入250mL圆底烧瓶中，加50mL抗坏血酸乙醇溶液(4.9) ，使试样完全分散、浸湿-FI于农陷上加热，混合直到沸点，用氮气吹洗稍冷却，加10mL氢氧化梆溶液(4.8)，混合均匀.在氮气流1、沸腾皂化阅流30min 不时振荡防止试样粘附在瓶壁L皂化结束.分别用5mL乙醇、5mL水自冷凝管顶端冲洗其内部，取出烧瓶冷却至约40C。7.1.2提取;王姓的转移全部皂化液于盛有100mL乙隧(
8、4.1)的500mL分液漏斗中，用3050mL ;餐馆水分Z3次冲洗圆底烧瓶并入分液漏斗，加j莲、放气，随后混合，激烈振荡2min，静罩、分层。转移水相于第二个分液漏斗中.分次用100、60mL乙酿重复摄取两次，弃去水相，合并兰次乙隧相。用蒸饱水每次100 mL洗涤乙隧提取液空中性，初次水洗时轻轻旋摇，防止乳化。乙院提取液通过无水硫酸纳(4.7)脱水.转移到250mL棕色容量瓶中，力日100mg BHT(4. 6)使之溶解用乙院定容至刻度(V，)以I二操作均在避光通风柜内进行。7. 1. 3 浓缩从乙酷提取液(V，)巾分取一定体积V.;)(依据样品标示量、称样量和提取液量确定分取量)tt于旋转
9、蒸发祷烧瓶中.在部分真空，水裕温度约50C的条件下蒸发至于或用氮气吹干。残渣)百正己烧溶解( )互相色消用甲醇溶解)，并稀释至10mLV.)使其获得的溶液中每毫升含维生素E(dl生育黝)SO._10Q吨离心或通过。.45m过滤膜过滤，收集清液移入2mL小试管中，1lJ予高效液相色谱仪分析。二Li7.2 测定7.2.1 高效液相色谱条件7- 2.1.1 正相色谱GB/T 17812-1999 柱t主，l2.5cm，内径4mm，不锈钢柱。固定相硅胶Lichrosorbsi60，粒度5mo移动相:正己烧十1，中二氧六环(97十3)，恒量流动。流速:1 mL/min。温度:室温。进祥体积:20L。检测
10、器紫外检测器，使用波长280nm。保留时间:4.3mino 7.2.1.2 反相色谱校长:12.5cm，内径4mm，不锈钢柱。固定相:ODS(或C18)，粒度5m。移动相:甲醇+水(95十5)。流速:1mL/min。温度:室温。进样体积:20L.检测器:紫外检测器，使用波长280nm。保留时间:11.17min。7.2.2 定量测定按高效液相色谱仪说明书调整仪器操作参数和灵敏度(AUFS)，色谱峰分离度符合要求(R注1.5) (中国药典1995版附录)。向色谱柱注入相应的维生素E(dl生育盼)标准工作液(4.10.2.V，)和试验溶液(7.1.3. V;)得到色谱峰面积的响应值(P，P.l，用
11、外标法定量测定。8结果的计算与表述8. 1 计算公式结果按式(1)计算g盹-PiXVuX Ven VMP X m X Vi X V i X f , 式中吨每千克样品中含维生素E的量，IU(或mg), m一一样品质量，g;V.一一提取液的总体积，mL;Vri一一从提取液(V.)中分取的溶液体积，mLsV , 试验溶液最终体积，mL;队标准溶液浓度，问/mL，V十维生素E标准榕液进样体积，L，Vi 从试验溶液中分取的进样体积，L，P. 与标准溶液进样体积(V，)相应的峰面积响应值3Pi 与从试验溶液中分取的进样体积(V，)相应的峰面积响应值;.( 1 ) J，一一转换系数，1国际单位(IU)维生素E相当于0.909mg dl生育盼，或1.0 mg dl-生育盼乙酸醋。8.2 平行测定结果用算术平均值表示，保留有效数3位。24( GB/T 17812一19999 允许差同一分析者对同一A试样同时两次测定(或重复测定)所得结果相对偏差。gb m 量含盼育生。ohlkh卢中样试克俨T每相对偏差.%土20士102 1
