1、GB/l 17999.4 . 1999 前言本标准是在我国建立的琼脂扩散试验(AG凹的基础上，并参照美国SPAFAS公司AGP操作规程编制而成。SPF鸡微生物学质量控制国家系列标准，包括SPF鸡微生物学监测总则和9种SPF鸡微生物学检测方法。本标准为(SPF鸡琼脂扩散试验。SPF鸡微生物学检测方法还包括以下部分:GB/T 17999. 1-1999 SPF鸡红细胞凝集抑制试验;GB/T 17999.2-1999 SPF鸡血清中和试验;GB/T 17999.3-1999 SPF鸡血清平板凝集试验;GB/T 17999.5-1999 SPF鸡酶联免疫吸附试验gGB/T 17999. 6 1999
2、SPF鸡胚敏感试验;GB/T 17999.7-1999 SPF鸡鸡自病沙门氏菌检验pGB/T 17999. 8-1999 SPF鸡试管凝集试验;GB/T 17999.9-1999 SPF鸡间接免疫荧光试验。本标准由中华人民共和国农业部、国家科学技术部提出。本标准由农业部畜牧兽医司归口。本标准起草单位E农业部实验动物研究中心、山东省农科院家禽研究所。本标准主要起草人:赵立红、陈德威、张秀美、靳彦华、秦卓明。77 中华人民共和国国家标准SPF鸡琼脂扩散试验G/T 17999. 4 1999 SPF chicken- Agar gel precipitalion lesl 1 范围本标准规定了琼脂扩
3、散试验所用试剂、材料，操作程序及结果判定等。本标准适用于SPF鸡感染以下病毒后的沉淀抗体的监测:禽流感病毒A型CAvianInflueza Virus Type A)、传染性支气管炎病毒CInfectiousBronchitis Virus)、传染性法氏囊病病毒(1nfectiousBursal Disease Viru川、传染性喉气管炎病毒(InfectiousLaryngotracheitis Virus)、禽症病毒(FowlPox Virus)、马立克氏病病毒CMareksDisease Virus)、禽脑脊髓炎病毒(AvianEncephalomyelitis Virus)、网状内皮增
4、生症病毒(ReticuloendotheliosisVirus)、禽呼肠孤病毒(病毒性关节炎)(Avian Reoviru川、禽腺病毒I群CAvianAdenovirus Group I )、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella mult配id)。2 原理琼脂扩散试验是种沉淀反应。抗原、抗体在含有电解质的琼脂凝胶中，可以向四周自由扩散，二再互相结合，在最适比例处出现沉淀线。常采用已知抗原检测相应的沉淀抗体。3 试剂和材料3. 1 试剂3. 1. 1 琼扩抗原。3. 1. 2 阳性血清。3. 1. 3 被检血清。3. 1.4 0.0IM，pH7.2、8%氯化纳磷酸缓冲液。3. 1. 5 优质琼
5、脂粉或琼脂糖。3. 2 材料3. 2. 1 琼扩板。3.2.2 打孔器。3. 2. 3 移液器。4 操作程序4. 1 琼脂板制备1 g优质琼脂粉或0.8glg琼脂糖加入100mLO. 01 M ,pH7. 2、8%氯化饷磷酸缓冲液中(检测|禽流感病毒感染时，同。.01mol/L ,pH6. 4的8%氯化纳磷酸缓冲液配制琼脂)，水浴加热融化，稍凉(60( 65 C)，但j入琼扩板内(厚度为3mm)，待琼脂凝固后，4C冰箱保存备用。4.2打孔用六角形打孔器在琼脂板上按7孔梅花图案打孔，孔径3mm4 mm，孔距3mmQ用8f头挑ti!国家质量技术监督局1999-11-10批准2000 - 04 -0
6、1实施78 G8/T 17999.4-1999 子L内琼脂，挑出时从孔一侧边缘插入针头，轻轻移动，等空气进入孔底后，再向挑出。4. 3封j民打孔完毕，封闭孔底。将板底部在酒精灯上烘烤，使底部琼脂微溶化即可，也可在琼脂孔底部与板接触处加少量溶化的1%琼脂或琼脂糖。4.4 加样用移液器滴加抗原子中间孔，周围1、4孔加阳性血清，其余孔加被检血清。加样时应将孔加满，不应出现凹形面，也不应溢出。4. 5 感作将琼扩板加盖保湿，放于37C温箱内作用24h72h.观察沉淀线。5 结果判定5. 1 阳性阳性血清与抗原孔之间有明显沉淀线时，被检血清与抗原孔之间也形成沉淀线，并与阳性血清的沉淀线末端吻合，则被检血清判为阳性。5. 2 弱阳性被检血清与抗原孔之间没有沉淀线，但阳性血清的沉淀线末端向被检血清孔偏弯，此被检血清判为弱阳饨(需重复试验)。5. 3 阴性被检血清与抗原孔之间不形成沉淀线，且阳性血清沉淀线直向被检血清孔，贝被检血清判为阴性。 79
