1、GB/T 17999.5-1999 前主口酶联免疫吸附试验(ELISA)是国外监测SPF鸡淋巴白血病病毒感染的通用方法。我国建立的淋巴臼血病ELISA方法敏感性高、特异性强、重复性好，已广泛用于商品种鸡场淋巴白血病的净化和SPF鸡场淋巴白血病病毒感染的监测，本标准在此基础上，规定了SPF鸡酶联免疫吸附试验。SPF鸡微生物学质量控制国家系列标准，包括SPF鸡微生物学监测总则和9种SPF鸡微生物学检测方法。本标准为(SPF鸡酶联免疫吸附试验。SPF鸡微生物学检测方法还包括以下部分:GB/T 17999. 1- 1999 SPF鸡红细胞凝集抑制试验gGB/T 17999.2-1999 SPF鸡血清中
2、和试验;GB/T 17999. 3-1999 SPF鸡血清平板凝集试验;GB/T 17999.4-1999 SPF鸡琼脂扩散试验;GB/T 17999.6 -1999 SPF鸡胚敏感试验;GB/T 17999.7-1999 SPF鸡鸡自娴沙门氏菌检验;GB/T 17999.8-1999 SPF鸡试管凝集试验;GB/T 17999.9-1999 SPF鸡间接免疫荧光试验。本标准由中华人民共和国农业部、国家科学技术部提出。本标准由农业部畜牧兽医司归口。本标准起草单位z农业部实验动物研究中心。本标准主要起草人g陈德威、张冰、赵立红、黄进、李军。80 中华人民共和国国家标准SPF鸡酶联免在吸附试验GB
3、/T 17999.5-1999 SPF chicken Enzyme-linked immunosorbent assay 1 范围本标准规定了酶联免疫吸附试验所用试剂、材料，操作程序及结果判定等。本标准适用于SPF鸡感染淋巴白血病病毒后的群特异性抗原的监测。2 原理检测SPF鸡蛋清中禽白血病病毒主要群特异性抗原P27的方法为双抗体夹心酶联免疫吸附试验。先用抗P27抗体包被酶标板，然后与蛋清作用，蛋清中的P27与包被抗体结合，洗去未结合的物质。再加入HRP兔抗P27抗体，作用后洗去未结合的酶标物。加入底物溶液，出现颜色变化。颜色变化的速度反程度与样品中P27的含量存关。3 试剂和器材3. 1
4、试部l3. 1. 1 包被抗体(兔抗P27IgG)。3. 1. 2 阳性抗原(P27)。3. 1. 3 阴性抗原。3. 1. 4 被枪蛋清。3.1.5 HRP兔抗P27.3. 1. 6包被液自0.05 mol/L , pH9. 6碳酸盐缓冲液配制tl，碳酸纳1.59g，碳酸氢纳2.93 g，蒸馆水加至1000 mL 3. 1. 7 洗涤液pH7.4、PBS-TWeen20配制，0.Olmol/L、pH7.4PB:号1000 mL，吐温20O. ., mL. 3.1.8 I良物溶液pH 5.0磷酸盐-拧橡酸缓冲液。PD-H202配制tl，Q. 2 mol/L磷酸氢二纳溶液25.7mL. Q. 1
5、 mol/L 朽橡酸溶液24.3mL，蒸饱水50mL，邻苯二胶(OPD)40mg ,30%H2020. 15 mL。3.1- 9 终止液，2mol月，硫酸。3. 2 器材3. 2. 1 酶标板。3.2.2 移液器。3. 2. 3 恒温培养箱。3. 2. 4 日.ISj主数仪。4 操作程序41 抗体包被Jf1包被液将兔抗P27IgG作适当稀释，每孔100L.4C过夜。国家质量技术监督局1999-11-10批准2000 - 04 -01实施81 GB/T 17999. 5 -c 1999 4. 2 洗谈:甩去包被液，每孔加满洗涤液(约300L)，静置3mn，甩干，如此重复3次。4.3 加样:每孔加
6、100L被检蛋清，设阳性、阴性对照孔，每个样品加两孔，37C作用60min。甩去样品，洗涤间上。4.4 每孔JmHRP兔抗P27(工作浓度)100L.37C作用45min -. 60 min，甩去HRP兔抗P27液，洗涤同k。4. 5 加底物溶液:每孔加100L新配制的底物溶液，避光作用15min 0 4. 6 终11二反应:每孔加终止液100L，4. 7 读00值终止反应后，迅速置ELISA读数仪上于490nm处读出各孔的00值。5 结果判定5. 1 当阳性对照00值与阴性对照。D值之差大于或等于O.3时，试验结果可靠。5. 2 按式(1) Wll被检样品的51P比值51P一样品。D值均数一阴性对照00值均数 . ( 1 ) 阳性对照00值均数一阴性对照00值均数式中S样品。D值;P 阳性对照00值。5. 3 判定，SIP注O.2，判为阳性;5Ip0.2，判为阴性。82
