1、GB/T 18089-2000 前蓝舌病(BLU)是种绵羊、牛、山羊等反驾动物的严重传染病，可通过检测血清中抗体的存在，确定动物是否感染本病。按国际上通常的方法，琼脂免疫扩散试验和酶联免疫吸附试验用于蓝舌病的定性，血清中和试验用于蓝舌病的定型。本标准根据国际常用的方法和我国多年的实践，采用鸡胚静脉接种是最为敏感、实用的病毒分离方法。蓝舌病病毒分离物可通过免疫荧光试验进行定性鉴定;用病毒中和试验进行定型鉴定。本标准是在参考美国、澳大利亚实验室的检测规程和总结我国在这一领域多年研究和实践经验的基础上制定。本标准的附录A是标准的附录。本标准由农业部提出。本标准起草单位:中华人民共和国昆明出入境检验检
2、疫局。本标准主要起草人:石世匡、张晓丁、徐自忠、徐维加、周晓黎。9衍中华人民共和国国家标准蓝舌病微量血清中和试验及病毒分离和鉴定方法G8/T 18089 2000 1 范围Micro-serum neutralization test! virus isolation and identification for bluetongue 本标准规定了监舌病微量血清中和试验及病毒分离和鉴定方法。中;标准适用于动物感染蓝舌病病毒后中和抗体的检测及病毒分离和鉴定。2 引用标准F列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各
3、方应探讨使用下石IJ标准最新版本的可能性。(; B/T 6682 1992 分析实验室用水规格和试验方法(eqvISO 3696 ,1 987) 3 缩略语3. 1 CPE致细胞病变作用。3.2 Tcm川半数组织培养感染量。3. 3 BLP乳糖蛋白陈缓冲肉汤。3.4 SPF;也特定病原体。4 原理4. 1 血清中和试验原理特异喉的血清，和抗体与病毒结合后.能使病毒失去对敏感细胞的感染能力，从而阻止病毒的繁趟。这一反应不但表现为4种病毒只能被相应的免疫血清所中和，而且还表现在中和一定量的病毒，必须奋-定效价的免疫血清。中和试验以测定病毒的感染力为基础.必须选用对病毒敏感的细胞、动物或鸡胚为实验材
4、料，中和抗体滴度的判定以比较病毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据。蓝舌病病毒感染动物后，7天左右出现中和抗体，中和抗体具有高度的型特异性，因此，可通过中和试验对蓝舌病病毒jf行定型鉴定。4 2 病毒分离及鉴定原理动物感染蓝舌病病毒后4天左右出现病毒血症，羊的病毒血症持续4周左右，牛的病毒血症持续8周左有，病毒主要存在于动物的红细胞内.并能从精液排毒。在动物病毒血症期，可从其血液、精液和脏器分离到病毒。用特异性荧光抗体做直接免疫荧光试验可对分离毒进行定饨鉴定，用已知标准阳性血清做病毒巾和试验可对分离毒进行定型鉴定。画家质量技术监督局200004-26批准2000-10-01实施97 GB/T
5、18089- 2000 5 试剂和材料本标准所用水应符合GB/T6682中三级水(三蒸水)的规格。本标准所用试剂配方见附录A(标准的附录)。下列试剂除特殊规定外，均指分析纯试剂。5. 1 病毒:蓝舌病病毒124血清型国际标准毒株，由国际兽疫局蓝舌病参考实验室提供。5. 2 对照血i青:蓝舌病标准阳性血清、阴性血清，由国际兽疫局蓝舌病参考实验室提供或者按国际兽疫局规定的方法制备及认定。5. 3 被检血清。5.4 细胞:C6!36、BHK21或Veroo5. 5 培养液，99培养基中加10%无蓝舌病病毒抗体的胎牛血清(经56C、30min灭能).含青霉素200IU/mL、链霉素200g/mL。5.
6、 6 维持液和稀释液，99培养基中加2%无蓝舌病病毒抗体的胎牛血清，含青霉素200IU/mL、链霉素200g/mL。5. 7 细胞分散液、液体石蜡、乳糖蛋白陈缓冲肉汤BLP)、碳酸缓冲甘油、0.01mo1/L PBS(pH7_ 2)。5. 8 荧光标记的蓝舌病病毒抗体。5.9 1011t:l韵SPF鸡胚。6 器械和设备6. 1 x鸟胚开孔器、照蛋箱或照蛋灯、乳钵或组织捣碎器、擦镜纸。6.2 超声波裂解器、1iiJ置显微镜、荧光显微镜。微型振荡器、二氧化碳培养箱、孵化器、冰箱(-20C保存血清.70C保存种毒)。6. 3 96孔组织培养板，单头和多头微量移液器(20200L)及滴头。7 蓝舌病微
7、量血清中和试验7. 1 病毒繁殖将蓝舌病病毒124(BLUVI24)血清型分别接种BHKn或Vero细胞单层，37C吸附1h后加入维持液，置5%二氧化碳培养箱于37C培养，接种24h后逐日观察。待CPE这75%以上，收获病毒培养物，冻融l次或置冰浴中用超声波处理(40uA、1m1时，2000r/min离心20min，分装小瓶，每瓶1mL , 置70C保存备用。7.2 毒价测定将各型病毒在96孔板上作IOO10-10稀释，每个稀释度作8孔，每孔病毒悬液为50L，加入细胞悬液100L(3X105个细胞/mLl，每块板设8孔细胞对照。置5%二氧化碳培养箱予3TC培养，从72168 h逐日观察记录CP
8、E。按K盯ber方法计算出各型病毒的TCID旷50L。7.3 试验程序7.3.1 蓝舌病标准阳性血清、阴性血清、被检血清经56C30min灭能。7. 3- 2 对照设立细胞对照.设4孔正常细胞对照，每孔加细胞悬浓100L(3X 105个细胞/mL)、稀释液100L。阴性对照:设4孔阴性对照，每孔加阴性血清和100TCID切/50L病毒悬液各50L，再加入细胞悬液100LC3XI05个细胞/mLl。一病毒回归对照将各型病毒稀释成1000、100、10、1TCID50/50L，每个稀释度作4孔，每孔加入病毒悬液50，d_.再加入细胞悬液100IL(3X 10个细胞/时_).每孔补充稀释液50L.竹
9、丛GB/T 18089- 2000 阳性对照将阳性血清分别作1, 4、1 8、1 16稀释，每个稀释度作4孔，每孔加各稀释度阳性血清和100TClDsc/50L病毒悬液各soL.再加入细胞悬液100I, L(3 X 10个细胞/mLl。血清毒性对照:每份被检血清须按稀释度各设-fL毒性对照.每孔加各稀释度血清50L，稀释液50L和细胞悬液1口。L(3Xl0个细胞/mL)0 7,4 中和试验7, 4, 1 将每份被检血清作1 4、1, 8、1 16稀释，每个稀释度作5个孔，每孔加各稀释度血清50L7.4.2 第I孔作为血清毒性对照，加入稀释液50L和细胞悬液100LC3XI0个细胞/mL)，7.
10、4.3 第24孔为正式试验孔，每孔加入病毒悬液50LCI00TCID号。/50L)，振荡3-5mtnj置37 C中和1h，加细胞悬液100LC3XI0马个细胞/mLl。7. 4. 4 宦5%:丁氧化碳培养箱于37(培养7天，24h后逐日现察CPE并进行记录。7.5 结果判定当病毒对照在1OO 300TCIDJ50L出现CPE，阳性、阴性、正常细胞、血清毒性对照全部成立时，才能进行flJii。判定时间为72168ho被检血清孔50%出现保护判为阳性，低于50%判为阴性。当某份血清的某稀释度出现50%或50%以上保护时J在血清稀释度即为该份血清的中和抗体滴度。当中和抗体滴度注1 8时判为阳性。试验
11、结果记录出现CPE己为:十5元CPE记王l。8 蓝舌病病毒分离8. 1 样品肝素抗凝血(每5mL血液用10IU肝素)、脏器(牌、肝、肾、淋巴结)、精液、库蝶。用于病毒分离的样品须胃冷藏容器保存，在24h内送到实验室，并立即进行处理。8. 1. 1 血液样品制备Jfj(月十素抗凝血;)mL.用PBS洗涤血佯34次，每次2000 r/min离心10min，弃上清液Ip加入倍最阳.P，民冰浴中用超声波处理(40uA、1min)后，经处理的样品当天使用，使用前置4C保存，剩余样品置70 (保存备用。8. 1. 2 组织样品市IJ备龙菌采集tJl物牌、淋巴结、肝、肾各;)g.剪碎后加入BLP10 mL(
12、含青霉素2000 IU/mL、链霉素2 000问/mLl，置乳钵中研磨，置4(冰箱浸提4h，取上清液5mL用超声波裂解处理(100uA、12 min)戎冻融7次，3000r/min离心20min，取上清液使用，使用前置4C保存，剩余样品置70C保存备用。8. 1. 3 精液样品制备取精液样品1mL，取0.5mL用BLP作125稀释后，3000r/min低温离心20min，弃仁清液，再用BLP作1 5稀释，充分混匀，置冰浴中用超声波处理(100uA、12 min) , 3000 r/min离心20min. 取t-.清液使用，使用前宦4C保存，剩余样品置70 C保存备用。8. 1.4 库蝶样品制备
13、 200 300个库嫁盛于小试管中，加入含青霉素2000 IU/mL，链霉素2000问/mL的BLP3 5mI，hl冰浴中研磨虫体，3000 r/min离心20m111.取上清液使用，使用前置4C保存，剩余样品置70 (、保f备用。8. 2 电胚静脉接种8. 2. 1 选择，lO 11 LI龄发育良好的SPF鸡胚，在照蛋nJ标记静脉位ill和开fL区，用ff孔器汗窗备用。.-)lJ GB/T 18089-2000 8.2.2 在无菌条件F.每份样品接种5个鸡胚，每个鸡胚接种0.1mL，接种后用擦镜纸封口，青33.5(、培养。8. 2. 3 逐日观察并记录.48h内死亡的鸡胚为非恃异性死亡，将4
14、8h后死亡的鸡胚收置4(冰箱保存，于接种后第6夭同未死亡鸡胚一起收毒。8.2.4 收毒:在无菌条件下，用硕酒、酒精棉球对鸡机气室处进行消毒，凿开蛋壳，按常规方法剪破壳腹、尿囊月震、羊模后，取出版体，景平皿中，在每个胚体上取若干组织块(有病变时，取病变组织、).置组织悔碎器或乳钵中研磨后，按1 5加入BLPC含青霉素2000IU/mL.链霉素2000月/时.).置c冰箱浸提4h.当日使用，剩余样品宦70(保存备用。8. 3 接种敏感细胞盲传8. 3. 1 按常规方法制备C川细胞单层。8. 3. 2 j阵收获的鸡腮上清液，接种细胞单层，每份病料接种两管.每管接种o.1 mL，置25C培养，第二天换
15、液后，培养7夭。8. 3. 3 按常规方法制l备BHK2或Vero细胞单层。8.3.4 第7天用吸管吹下被接种的C!35细胞。8. 3. 5 将吹下的CSi36细胞悬液接种于BHK或Vero细胞单层.37C吸附1h后，加入维持液置37C培养，24hJ:5逐日观察细胞病变，连续观察7天。9 蓝舌病病毒鉴定9. 1 荧光抗体试验(直按法)9. 1. 1 j￥接种的日HK或Vero细胞培养物冻融一次.1 000 r /min离心10min，取上清液接种于带有玻片的2.1才L组织培养板的BHK或Vero细胞单层。每份样品接种两孔，同时设阳性、阴性对照，3/C吸附1h后讪入维持液，置3TC培养72h ,
16、 9. 1. 2 取J11府养板中的玻片，用。.01mol/L PBS漂洗一次，预冷丙酬固定15min 0 9. 1. 3 每片滴加费光标记的夜舌病病毒抗体，使其覆盖于玻片，置暗湿盒中r-3TC作用30mino 9.1.4 用。01mol/L PBS 洗片三次，再用蒸馆水洗片一次。9. 1. 5 风干.用碳酸缓冲甘油封片，荧光显微镜检查。9. 1. 6 结果判定:在阳性对照细胞浆内呈现颗粒状的黄绿色荧光.阴性对照应无荧光或无特异性荧光时，细胞浆内发现颗粒状的黄绿色荧光者即可判为阳性。9. 2 病毒中和试验9. 2. 1 病毒繁殖:收获在BHK或V盯0细胞上出现CPE的病毒悬液，复壮一代，待CP
17、E达85%以上.收获病毒培养物冻融1次.2000 r /min离心20min.分装置一70C保存备用。9. 2. 2 毒价泪.方法同蓝舌病微量血清中和试验。9. 2. 3 按Karber方法计算出TCID，/501止，用100TCID50/50L蓝舌病病毒分离毒株分别与不同血清型的蓝首病病毒标准阳性血清(效价不低于1 32)作微量中和试验。9.2.4 试验在96孔组织培养板上进行，阳性血清、阴性血清经56C30 min灭能。各型阳性血清作1 10稀释。9. 2. 5 操作步骤9.2.5.1 对照设立一一细胞对照设4孔正常细胞对照，每孔加细胞悬液100L(3Xl0个细胞/m).)、稀释液100
18、I，L。附件，对照设4孔Ifr仁对照.每孔加阴性血清和100TCID，o/50L病毒悬液各50L.再加入细胞悬液100L(3Xl0个细胞/m.)。病毒团。对照:将被鉴定病毒稀释成1000.100、10、1TC)，/50L.每个稀释度作4孔，每孔I ()( ) G8/T 18089-2000 加入病毒悬液50L，再加入细胞悬液100LC3X10个细胞/mL)，补充稀释液50L。9. 2. 5. 2 正式试验每个血清型作4孔，每孔加1, 10稀释的阳性血清和100TClD，/50L病毒各50L.振荡3.-Smln，置37C中和1h，加入细胞悬液100L(3XIO个细胞/m.)0 9. 2. 5.
19、3 结果判定按照蓝舌病微量血清中和试验方法7.5进行判定:判定时间从72168ho经1 10稀释的蓝舌病某型标准阳性血清能与病毒中和，使50%以上的细胞不出现CPE者判为阳性，即为所鉴定病毒的血清型。11 ) I G8/T 18089 . 2000 附录A(标准的附录)溶液配方A1 营养液，199培养基.加入含10%元蓝舌病病毒抗体胎牛血清，抽滤除菌。A2 维持液，199培养基，加入含2%元蓝舌病病毒抗体胎牛血清;抽滤除菌。A3 细胞分散液:腆酶2. 50 g; 乙二胶同乙二酸二纳(EDTA)O. 20 g; 无钙筷PBS1 000 ml.; 他滤除菌A4 手L糖蛋白陈缓冲肉汤Wl.刊a)磷酸
20、-氢纳(无水)1. 60 g; 二蒸水500 ml.。b) )/a，HPO斗(无水)9.40 g; 三蒸水1000 ml.; 工作液:a液220 ml.; b液780 ml.; 蛋白陈2. 00 g; 乳糖100 g; . 10磅J5mm高压灭菌或抽滤除菌。A5 0.01 mol/l. PRS pH7. 27. 4 磷酸氢1纳1. 19日;磷酸工氧纳O. 22 g; 氯f七例8.50 g; 蒸饱水1 000 ml.。A6 破酸缓1中甘油a) 0.5 mol/L pH9. 5碳酸缓冲液碳酸氢纳3. 70 g; 碳酸纳(无水)O. 60 g; 蒸馆水100 mL。b)甘油1份碳酸缓冲力n9份甘i由混合即成。f iz实验听用试开J除有特殊规定外，均需高压灭前。I (I:!
