1、GB/T 18090-2000 前言猪繁殖和呼吸综合症(简称PRRS)是由PRRS病毒引起的种接触传染性疾病。各种年龄的猪均易感染。娃振母猪感染后可引起流产、死胎、木乃伊胎及弱胎，仔猪可发生呼吸障碍和高病死率，其他猪常呈隐性感染或仅出现轻度的呼吸道症状。PRRS病毒有欧洲型和美洲型两种主要抗原型，分别以LV和VR-2332为代表株，型间具有明显的抗原交叉反应性。据现有资料，我国流行的毒株为美洲型。本病几乎发生于世界各养猪国家，并于九十年代中期传入我国。由于其对养猪业的严重威胁性，国际兽疫局( 996)已将本病列为B类传染病。大连动植物检疫局在国内率先开展了PRRS的研究工作，建立了具有与国际同
2、等水平的病毒分离鉴定、间接免疫荧光试验和血清中和试验等诊断方法。其他单位也相继建立了多种酶联免疫吸附试验等。本标准是在综合我国科研成果的基础上，参照国际兽疫局(OIE)编写的哺乳动物、禽和蜜蜂A和B类疾病诊断试验和疫苗标准手册)(第三版.1996)编写的。其技术内容与OIE所推荐的基本一致。本标准的附录A、附录B和附录C都是标准的附录。本标准由农业部提出。本标准起草单位:中华人民共和国大连动植物检疫局。本标准起草人:孙颖杰、苏永生、潘凤城、孙延峰、筒中友。1 可1 范围中华人民共和国国家标准猪繁殖和呼吸综合症诊断方法Diagnostic methods of porcine reproduct
3、ive and respiratory syndrome 本标准规定了猪繁殖和呼吸综合症(PRRS)的诊断方法。本标准适用于猪繁殖和呼吸综合症的诊断。2 诊断方法的种类和选用GB/T 18090-2000 PRRS的诊断方法有多种。依据临床症状和病理变化只可作出初步诊断，确诊必须依靠实验室检查。目前已建立和应用的实验室诊断技术有病毒的分离与鉴定、免疫过氧化物酶单层试验OPMA)、IliJ接免疫荧光试验OFA)、间接酶联免疫吸附试验(间接ELISA)和血清中和试验(SN)等。病毒的分离与鉴定多用于急性病例的确诊和新疫区的确定。其余4种方法主要用于检测tlPRRS病毒抗体。IPMA.IFA和间接E
4、LISA三者特异性相似，但以间接ELlSA的敏感性最高。应用这三种方法一般不易区别病毒的抗原类型，故多适用于确定病性。SN反应具有明显的抗原型别差异，因此，它既适用于确定病性，也适用于鉴定病毒的抗原类型。中和抗体出现最晚，不适合于早期诊断。本标准指定上述五种实验室诊断技术为我国进出境和国内生猪PRRS的诊断方法，保证了我国对PRRS的诊断与国外的致性。在实际应用时，可根据需要和条件，从中选用12种方法即可。3 病毒的分离与鉴定3- 1 材料准备3- 1. 1 器材，96孔细胞培养板、微量移液器、恒温水浴箱、二氧化碳(C02)恒温箱、普通冰箱及低温冰箱、离心机及离心管、组织研磨器、孔径。.2m的
5、微孔滤膜、普通光学显微镜。3- 1. 2 试剂，RPM1l640营养液、楼牛血清、青霉素(10IU/mL)与链霉素(10问/mL)溶液、7.5%碳酸氢销溶液等。3- 1. 3 细胞培养物:猪原代肺泡巨噬细胞培养物(PAM)或MARC-145或HS2H细胞。PAM由无PRRS猪获取.并经批次检验合格，制备和检验方法见附录BoMARC-145或HS2H细胞由国家指定单位提供。3-1.4样品3.1.4.1 样品的采取和送检在发病早期，无菌地采取病猪的血清或腹水。对病死猪(如流产的死胎)和l扑杀猪(如弱胎猪)，应立即采取肺、扁桃体和脾等组织数小块，琶冰瓶内立即送检。不能立即检查者，应放25正-:lOC
6、冰箱中，或加50%甘油生理盐水，4C保存送检。3.1.4.2 样品的处理:血清和腹水可直接使用。肺、脾和扁桃体等组织可单独使用，也可混合后使用。各组织剪碎后研磨成糊状，加入RPM1l640营养液，制成10%悬液，3000Xg离心15rnn，吸取L清液，1m入青霉素5001U/mL、链霉素500问/mL、庆大霉素5001g/mL和两性霉素B200g/mLo怀疑有细菌国家质量技术监督局2000-04 -26批准2000-10-01实施J (1 I G/T 18090-2000 污染的样品，也可用。.2m微孔泼、膜过滤处理。3. 2 操作方法3- 2. 1 稀释样品.取96孔细胞培养板每孔加入细胞培
7、养液RPM1l640(含槟牛血清10%、青霉素100 IU/mL、链霉素100吨/mL、庆大霉素50问/mL、两位霉素B10问/mL、pH=7.2190L，在A1和C1孔内加入同份己处理的样品各10L(样品10X稀释)。将板轻轻摇动后，从A1和C1排孔各取10L分别移入B1和Dl排孔内(样品100X稀释)。除第6和第12列留作正常细胞对照外，其他各孔的样品稀释方法同上。振动稀择板后加盖，置4C冰箱内保存备用。3.2.2 制备细胞板:已建立的某些猴肾细胞系不能支持所有分离物特别是欧洲型病毒株的良好生长，因此病毒分离应首选PAM细胞，先将PAM细胞泥用细胞培养液RPMIl640稀释，使细胞终浓度为
8、1 X 10细胞/mL。或将MARC-145或HS，H细胞用MEM细胞营养液稀释，细胞终浓度为5X10细胞/mL。然后，在另一块96孔细胞培养板上每孔加入上述细胞悬液100L.愤照上述操作，每板可检测20份样晶，每份样品重复2个滴度c第6和第12列留作正常细胞对照(不接种样品)。3.2.3 接种样品:由样品稀释板每孔内各吸取稀释的样品液50L，接种于已形成细胞单层的细胞板相应的孔内(第一代)。细胞板加盖后，放入37C5%二氧化碳保湿恒温箱中培养，每天观察致细胞病变作用(CPE1，连续观察2d5 d.CPE通常在接种后1d4 d内出现，主要呈现细胞圆缩、聚集、固缩，最后溶解脱落。3.2.4 培养
9、物盲传:根据第一代培养物CPE出现的情况(通常在接种后的第2d3 d1安排盲传。盲传时，不论CPE有无，一律各取孔内混悬液25L，移入新细胞板相应的孔内。再于37C5%二氧化碳保湿恒温箱中培养2d5 d，每天观察CPE.3. 3 结果的判断和解释在第二代培养结束时，不论是否出现CPE，对所有的孔必须采用免疫过氧化物酶单层试验。PMA1或间接免疫荧光试验CIFA1进行终判;只要对PRRS病毒阳性血清呈现阳性反应，则被认定为PRRS病毒分离阳性。4 免疫过氧化物酶单层试验CIPMA14. 1 材料准备4. 1. 1 器材:微量移液器、倒置显微镜等。4.1.2试剂4. 1.2.1 IPMA 诊断板的
10、制备z见附录B。4.1.2.2 标准阳性血清、标准阴性血清和兔抗猪过氧化物酶结合物均由国家指定单位提供。使用前按说明书规定用血清稀释液稀释至工作浓度。4.1.2.3 洗涤液、血清稀释液和显色/底物溶液依照附录A自行配制。4.1.3 样品:采集被检猪血液，分离血清，血清必须新鲜透明不溶血无污染，密装子灭菌小瓶内，4C或:lO C冰箱保存或立即送检。试验前将被检血清统一编号，并用血清稀释液作20倍稀释。4.2 操作方法参照图1。105 G/T 18090-2000 V 飞产v v V V斗ABEDEFG V 感染PRRS病毒的细胞列，V未感染PRRS病毒的细胞列，C一空臼对照孔，p标准阳性血清对照
11、孔;N 标准阴性血清对照孔;51、S2、S3等被检血清编号图1IPMA和IFA诊断板加样示意图4.2.1 取己作20倍稀释的被检血清加入IPMA诊断板同一排相邻的2个病毒感染细胞孔(v勺及其后的1个未感染细胞孔(v-)内(参照图1)，每孔50L.同时设立标准阳性血清、标准阴性血清和空白对照，以血清稀释液代替血清设立空白对照.封板并于4C条件下过夜。4.2.2 奔去板中液体，用洗涤液洗板3次，每孔100L，每次1min_ 3 min，最后在吸水纸上轻轻拍干。4.2.3 每孔加入工作浓度的兔抗猪过氧化物酶结合物50L，封板后放在保湿盒内于3TC恒温箱中感作60min , 4.2.4 弃去板中液体，
12、洗涤三次，方法同4.2. 2。4.2.5 每孔加入显色/底物溶液50L，封板于室温(l8C24c)下感作30mo o 4.2.6 弃去板中液体，洗涤1次，方法同4.2. 2，再用三馆水洗涤2次，最后在吸水纸上轻轻拍干，待检。4.3 结果判定与解释将IPMA诊断板置于倒置显微镜下判渎。在对照标本都成立的前提下，即空白对照感染细胞孔(P V I )和未感染细胞孔CP V-)均应为阴性反应z标准阳性血清对照感染细胞孔(P V应呈典型阳性反应，未感染细胞孔CP V-)应为阴性反应，标准阴性血清对照感染细胞孔CN V+)和未感染细胞孔(N V-)均应呈阴性反应;被检血清未感染细胞孔(V-)不应出现阳性反
13、应。被检血清标本的细胞浆(可能仅见于部分细胞)出现弥漫状或团块状棕红色着染者，判读为免疫过氧化物酶单层试验阳性，记作IPMA(十);元棕红色着染者，如l读为免疫过氧化物酶单层试验阴性，记作IPMA(-).IPMA( +)者表明被检猪的血清中含有PRRS病毒的抗体。间接免疫荧光试验(lFA)5 5. 1 材料准备5. 1. 1 器材:荧光显微镜、恒温箱、保湿盒、微量移液器等。5.1-2试齐J5.1.2.1IFA诊断板的制备z见附录B.5.1.2.2 兔抗猪异硫氨酸荧光黄CFITC)结合物、标准阳性血清和标准阴性血清，由国家指定单位提供。5.1.3 样品:采集被检猪血液，分离血清，血清必须新鲜、透
14、明、不溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，4C 或30C冰箱保存或立即送检。试验前将被检血清统一编号，并用PBS液作20倍稀释。5. 2 操作方法5. 2. 1 取IFA诊断板，编号，弃去板中的乙醇溶液，宣超净工作台中风干每孔加10011L PBS液洗一次，奔去PIlS液并在吸水纸上轻轻拍干。(l GB/T 18090-2000 5.2.2 在编号对庶的.fL内加入201昔稀释的被检血清:同一排相邻的感染细胞孔2个及其后元感染细胞孔l个.每孔100L，同时做标准阴、阳性血清及空臼对照，空白对照是用PBS液代替血清。?于37C 恒温箱巾感作15mn 0 5.2.3 弃去板中血清，用PBS液洗板4次，
15、每孔100L，每次3min，最后在吸水纸上轻轻拍干。5.2.4 每孔加入工作浓度的兔抗猪F!TC结合物50L，在37C恒温箱中感作45min 0 5.2.5 弃去板中结合物，同5.2. 3方法洗涤3次后，最后在吸水纸k轻轻拍干。5. 3 荧光显微镜检查及判定与解释荧光显微镜采用蓝紫光(激发滤板通常用BG12，吸收滤板用OGj或GG，)，在5倍10倍目镜下检奋。标准阳传血清对照中感染细胞孔(P V)应出现典型的特异性荧光，而未感染细胞孔(P V -)不应出现特异性荧光;标准阴性血清对照、空白对照中感染细胞孔(N V )和未感染细胞孔(N V-)均不应iii现特异性荧光g被检血清对照中未感染细胞孔
16、(C V-)不应出现特异性荧光。被检血清样品感染细胞孔(N V t )出现特异性胞浆亮绿荧光的李1I为阳性，否则，如j为阴性。间接酶联免疫吸附试验(间接ELISA)6 6. 1 材料准备6. 1. 1 器材396孔平底微量反应板、微量移液器、酶标测定仪、恒温箱、保湿盒等。6. 1. 2 试齐16.1.2.1 PRRS病毒抗原和正常细胞对照抗原，由国家指定单位提供。使用前，按说明书规定用抗原稀释液稀释工作浓度。6. 1. 2. 2 兔抗猪!gG辣根过氧化物酶结合物(简称酶标抗体)由国家指定单位提供。使用前按说明书规定用血清稀释液稀释至工作浓度。6.1.2.3 PRRS病毒标准阳性血清和标准阴性血
17、清，由国家指定单位提供。使用前按说明书规定用血清稀释液稀释至工作浓度。6.1.2.4 抗原稀释液、血清稀释液、洗涤液、封闭液、底物溶液、终止液等，依照附录A自行配制。6.1.3 样品:采集被检猪血液，分离血清，血清必须新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，4C 或30 C冰箱保存或立即送检。试验前将被检血清统一编号，并用血清稀释液作20倍稀释。6. 2 操作方法参照图2。12 11 0 9 8 7 6 5 P P 53 S3 P P S3 S3 N N S4 54 N N S4 54 S1 S1 S5 S5 S1 S1 S5 S5 S2 S2 S6 S6 S2 S2 S6 S6 4 3
18、 2 l ABCDEFGH C V C v C v C V C V C v V 为PRRS病毒抗原包被列，C正常细胞抗原包被;lJ,F 标准阳性血清对照孔pN 标准阴性血i青对照孔;Sl、52、53等被检血清编号图2间接ELlSA诊断板加祥示意图6. 2. 1 包被抗原:取96孔平底微量反应板，于奇数列加工作浓度的病毒抗!反，偶数列加工作浓度的对照抗原.悖于L100L(参照图刀，封板，置保湿盒内放37C恒温箱中感作60min，再移置4C冰箱内过f宜。6.2.2 洗板弃去板中包被液，加洗涤液流饭，每孔100L.洗涤3次，每次1min 0在吸水纸上轻轻拍!07 GB/T 18090-2000 干。
19、6.2.3 封闭z每孔加入封闭液100L.封板后置保湿盒内于3TC恒温箱中感作60mn , 6.2.4 洗涤z方法同6.2.2。6.2.5 加血清:反应板按图2编号后，对号加入已作稀释的被检血清、标准阳性血清和标准阴性血清。每份血清各加2个病毒抗原孔和2个对照抗原孔，孔位相邻。每孔加样量均为100L。封板，置保湿盒内于37C恒温箱中感作30min 6. 2. 6 先板方法同6.2. 2, 6.2.7 加酶标抗体z每孔加工作浓度的酶标抗体100L.封板，放保湿盒内置3TC恒温箱中感作30 min , 6.2.8 洗板:方法同6.2. 2, 6.2.9 加底物每孔加入新配制的底物溶液100L.封板
20、，在3TC恒温箱中感作15mino 6.2.10 加终止液z每孔添加终止液100L终止反应。6.3 光密度(00)值测定与计算6. 3. 1 00值测定在酶标测定仪上用650nm读取反应板各孔溶液的00值，记入专用表格。6.3.2 00值计算值。按下式分别计算标准阳性血清、标准阴性血清和被检血清与2个平行抗原孔反应的00值的平均标准阳性血清(P)与病毒抗原(V)反应的均值P V(OOo)按式。)计算zP V(OOo)二Al(OOo)+ Bl (000) J/2 . . . ( 1 ) 标准阳性血清(P)与对照抗原(C)反应的均值P C(OOo)按式。)计算gP C(OOo) A2(00，0)十
21、B2(00650)J/2 .( 2 ) 标准阴性血清(N)与病毒抗原(V)反应的均值N V(OOo)按式(3)计算:N . V(OOo)二C1(00，0)十01(00650) J/2 .( 3 ) 被检血清(S)与病毒抗原(V)反应的均值S V(00650)按式(4)计算.S V(OOo) El(OOo) + F1(0065O )J/2 (以Sl血清为例). ( 4 ) 被检血清(S)与对照抗原(C)反应的均值S C(OOo)按式(5)计算:S C (000) E2 (00，0)十F2(0065O)J/2 (以Sl血清为例)( 5 ) 6. 3. 3 按式(6)计算被检血清00值与标准阳性血清
22、00值的比值S/P:S/P S V(00650) - S C(00650)J/P V(00650) P . C(0065O) J ( 6 ) 6.4 结果的判定与解释6.4.1 有效性判定:p.V(OO旧)与N V (00650)的差值必须大于或等于0.150时，才可进行结果判定。否则，本次试验无效。6.4.2 判定标准与解释a) S/P比值小于0.3.判定为PRRS病毒抗体阴4性，记作间接ELISA(一)。b) S/P比值大于或等于O.3.小于0.4.判定为疑似，记作间接ELISA(士)。c) S/P比值大子或等于0.4.判定为PRRS病毒抗体阳性，记作间接ELISA(+)。间接ELISA(
23、十)者表明被检猪血清中含有PRRS病毒抗体。7血清中和试验(SN)7.1 材料准备? 1. 1 器材:96孔细胞培养板、微量移液器、二氧化碳(CO，)恒温箱、倒置显微镜等。7.1.2 病毒2美洲标准株ATCCVR.2332或欧洲标准株LV.由国家指定单位提供。使用前按附录C方法滴定病毒效价后，用含20%健康猪新鲜血清的EMEM营养液(pH7.2)将其稀释至200TCID5O/IOH GB/T 18090-2000 25L，作为工作病毒液。7.1.3 细胞:MARC-145或HS，H传代细胞，由国家指定单位提供。使用时，用细胞分散液消化、分散细胞. t数，再用EMEM营养液(含楼牛血清10%.青
24、霉素100IU /mL.链霉素100吨!mL.pH=7.2)稀释至10细胞/mL。7.1.4 试剂7.1.4.1 PRRS病毒标准阳性血清和标准阴性血清，由国家指定单位提供，使用前经56C灭活30min , 并按说明书规定进行稀释。7.1.4.2 健康猪新鲜血清:无菌采自38月龄的无PRRS的健康猪，可于一70.C低温冰箱保存。使用时不灭活。7. 1. 5 样品无菌采集被检猪血清，血清必须新鲜、透明、无溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，4-C保存或立即送检，检测l前经56C灭活30min。由于中和抗体产生稍晚，故该血清以在疾病中后期或病毒感染后23周时采集为宜。?2 操作方法参照图3.4阴性血清
25、对照4阴性血清对照12 SI P SI P S2 N S2 N S3 100 10 o. 1 S3 100 10 o. j S4 100 10 1 o. I 54 100 10 1 o. 1 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 ABCDEFGH A 细胞对照A 病毒对照A 细胞对照A 被检血清毒性对照P一标准阳性血清对照;N标准阴性血清对照，51、52、53等被检血清编号.100、10、1、o.1一病毒浓度TCJD50图3血清中和试验第1块板加样示意图7.2.1 加营养液取96孔细胞培养板，编号，于各血清检测孔内加入EMEM营养液(含10%楼牛血清、100IU!时，青霉素、100吨
26、/mL链霉素.pH=7.2)25L.细胞对照区各孔加50L，病毒对照区各孔不加(参照图3)。7-2.2 加被检血清:以单头微量移液器精确吸取己作灭活处理的被检血清，在各排头两孔各加入25L。每份被检血清须平行安排两排，即每个稀释度两孔。7.2.3 稀释被检血清从第2列开始依次向后将被检血清作倍比稀释，使第2、3、4、5，6列孔的血清稀释俏数依次为21、2、2、2、2S。稀释时，用8头微量取样器先在第2列孔内吹吸数次，充分混匀后吸取25L移入第3列，同前棍匀后取25L移入第4列，以下依次进行。当第6列各孔混匀后，各吸取25l弃去。稀释过程中切勿产生气泡。7-2.4 稀释对照血清g同7.2.3法进
27、行标准阳性血清和标准阴性血清稀释。? 2. 5 加病毒液z除血清毒性对照、病毒对照和细胞对照外，各孔添加用含20%健康猪新鲜血清EMEM营养液，将病毒液稀释成200TClD旷25L的工作病毒液25L。7.2.6 病毒对照取灭菌试管4支，用20%健康猪新鲜血清EMEM营养液(pH7.2)将病毒液稀释3含毒量为200TCID旷25L、20TCID/25L，2 TClDso!25L和o.2 TClDso/25L4个滴度，然后参照因3各取25L加入相应的孔内(每个滴度4个孔).再于各孔内加入25L2倍稀释的标准阴性血清。此时，病毒浓度分别降为100TCID，/25L、10TCID，/25L、1TCID
28、so/25L和O.1 TCIO, /25 7.2.7 jU9 中和感作z将培养板放入37.C的5%二氧化碳保湿恒温箱中感作60mino GB/T 18090- 2000 7.2.8 添加细胞:于每孔内加入配制好的MARC.145或HS，H细胞法液50I, Lo 7.2.9 培养z封板后，放入37C的5%二氧化碳保湿恒温箱内培养。?3 观察与记录在倒置显微镜下逐孔观察致细胞病变作用(CPE)。每天观察一次，连续观察5天，并将观察结果记入专用登记表内。PRRS病毒在MARC.145或HS2H细胞上生长，引起的CPE仨要是细胞圆缩、聚集、周缩，最后溶解脱落。7.4 中和效价汁算和结果判定在各对照组符
29、合下述要求时，本次中和试验才成立。a)病毒对照:病毒浓度为O.1 TCID50的各孔不应出现任何CPE，100 TCID50的各孔均应出现CPE。b)血清毒性对照:相当于试验中最低稀释度(本标准中为2倍)的被检血清对细胞应没有任何毒性作用。c)细胞对照:在整个试验中应一直保持良好的形态和特征。d)阳性血清对照zi式验中所显示的能抑制CPE出现的血清最高稀释度不应比其已知滴度差1个滴度以上。e)阴性血清对照:各稀释度均应出现CPE。对被检血清的中和效价进行计算。其血清中和效价为能抑制平行两孔或两孔中孔出现CPE的血清最高稀释倍数的倒数。血清中和效价大于或等于1: 4.判定为血清中和试验阳性，记作
30、SN(十);小于1 : 4.判为阴性，记作SN(-).SN(+)表示被检猪血清中含有PRRS病毒抗体。8 综合判定当在临床上怀疑有PRRS病毒感染时，可根据实际情况，由上述五种方法中选用一种或两种方法进行确诊。对于未接种过PRRS疫苗或已超越疫苗免疫期的猪，经任何一种方法检测呈现阳性结果时，都可最终判定为PRRS病毒感染猪。对接种过PRRS灭活疫苗并在疫苗免疫期内的猪，当病毒分离鉴定试验为阳性结果时，可终判为PRRS病毒感染猪;当仅血清学试验呈阳性结果时，应结合病史和疫苗接种史进行综合判定，不可-律视为PRRS病毒感染猪。1 j( ) GB/T 18090-2000 附录A(标准的附录)血清学
31、试验中试剂的配制A1 PBS液0.01mol/L PBS ,pH= 7. 2)用于IFA氯f七锵(NaCI)氧化何KC!)碳酸氢俐(NaHCO，)磷酸二氢梆(KH，PO.)二:蒸水加至保存于4C备用。8 g; 0.2 g; 1. 15 g; O. 2 g; 1 000 mL; A2 洗涤液(0.01 mol/L PBS-O. 05 %吐温-20，pH=7.中用于IPMA和间接ELISA磷酸二氢御(KH，PO，)磷酸氢P纳(Na，HPO，. 12日，()氯化纳(NaC!)练化专甲(KCIJ吐温20三蒸水b日至现用现配。O. 2 g , 2. 9 g , 8. 0 g , O. 2 g , 0.5
32、 mL; 1 000 mLo A3 抗原稀释液(0.05mol/L碳酸盐缓;中液.pH9. 6)用于间接ELISA碳酸纳CNa，CO，)碳酸氧纳(NaHCO，)二蒸水加至4C保存.周内用完。A4血清稀释液用于IPMA辛DELISA J，J含1%楼牛血清的Al液。A5封闭法用于间接ELISA1. 59 g , 2. 93 g; 1 000 mL。为含1%楼牛血清白蛋白或10%马血清的Al液。A6显色/底物溶液用于IPMAA6.1 AEC贮非液称取氨乙基咔唆(3-amno-百一ethyl-carbazole.AECl 4 mg溶于二甲基甲酸胶(N.N-dimethy-for mamide l1 m
33、L中，充分溶解后置4C避光保存。A6.2 乙酸俐溶液乙酸纳(CH，COONa)加气惚水至用Jj(乙酸调整一王pH=5.0。4. 15 g , 1000 mL, j 1 1 A6.3 乙酸盐缓冲液冰乙酸CCH3COOH)乙酸纳溶液三馆水充分混匀。A6.4 显色/底物溶液CAEC-H，O，)乙酸盐缓冲液AEC贮存液GB/T 18090-2000 14.8 mL; 35.2 mL; 50.0 mL; 19 mL; 1 mL; 30%过氧化氢CH，O，)0.067 mL; 充分混合后装于褐色玻璃瓶内避光存放。现用现配。A7底物溶液用于间接ELISAA7.1 0.1 mol/L拧橡酸溶液拧橡酸CC.H.
34、O，)加兰馆水至A? 2 0.1 mol/L磷酸氢二纳溶液磷酸氢二销(Na，HPO. 12H,O) 加三饱水至A7.3 底物溶液CTMB-H，O，)0.1 mol/L拧橡酸溶液0.1 mol/L磷酸氢二纳溶液四甲基联苯胶CTMB)1. 92 g; 100 mL。3. 58 g; 100 mL , 33.0 mL; 66.0 mL; 40.0 mg; 30%过氧化氢CH，O，)1. 5 mL; 充分混合后装于褐色玻璃瓶避光存放。现用现配。A8终止液用于间接ELISA1 mol/L氢氟酸CHF)溶液。附录B(标准的附录)猪肺泡巨噬细胞CPAM)制备、鉴定、保存与复苏B1 试剂准备B1.1 磷酸盐缓
35、冲盐水CPBS)a)原液甲氯化销(NaCl)氯化例CKCl)8. 00 g; o. 20 g; 磷酸氢二销CNa，HPO.)1.15 g; 磷酸二氢梆CKH，PO.)o. 20 g , 溶于500mL三馆水中，再加入5mL 0.4%盼红液，加三馆水至800mL. 56 kPa 20 min灭菌备用。b)原液乙112 氯化续(MgCI，. 6H,O) 加三馆水至56 kPa 20 min灭商备用。c)原液丙GB/T 18090-2000 O. 1 g; 100 mL。氯化钙(CaCI，)O. 1 g 溶于100mL三馈水中，56kPa 20 mm灭菌备用。d)工作液原液甲8份;原液乙原液丙1份s
36、l 份。充分混合后备用。必要时.jjJ适量加入抗生素(青霉素103IU/mL、链霉素103陈/mL、庆大霉素10用/mLl.不加制霉菌素。B1.2 细胞生长液含10%续牛血清的RPMIl640营养液(含青霉素100IU/mL、链霉素100月/mL、庆大霉素50g/mLl。B1.3 细胞冻存液取细胞生长液8.0mL.加入分析纯二甲基亚枫(DMSO)2.0mL.混合均匀。不加制霉菌素。B2 PAM的制备取48周龄的SPF猪或被证实无PRRS病毒感染的健康猪，动脉放血致死后，立即无菌操作取出肺，切勿划破被膜。每次用约200mL PBS液从气管灌入肺.挤压灌洗34次，收集灌洗液.1000Xg离心10m
37、in，得到的巨噬细胞泥用PBS液再悬浮和离心洗涤23次。最后的细胞泥用50mL细胞生长液悬浮，进行细胞计数，用细胞生长液稀释使细胞浓度达4XI0/1.5mLo所得新鲜巨噬细胞立即应用或定量分装后冻存。B3 PAM的冻存取细胞浓度为8X10/1.5mL的细胞悬液，加入等量细胞冻存液，缓慢滴加，边加边振摇。加毕，方即用聚苯乙烯管分装，每管1.5mL.放一70C过夜，转入液氮中保存。液氮保存各批巨噬细胞，不可混合。B4 PAM的批次试验每批巨噬细胞应检验合格后再使用。方法是，在96孔细胞培养板上用已知滴度的标准病毒感染巨噬细胞，并用标准的阳性血清和阴性血清进行IPMA或IFA测定。只有能支持特定滴度
38、的标准病毒良好生长的巨噬细胞，方可用于试验。B5 PAM的复苏从液氮中取出冷冻细胞管，立即投入温水(3SC左右)中迅速解冻。将细胞移入10倍量的RPMl!640营养液(pH7.2)中.1OOOXg离心10ffiln，弃去上清液，沉淀的细胞用细胞生长液悬浮，汁数，稀释至要求的细胞浓度后，即可使用。B6 IPMA 诊断板的制备用细胞分散液消化Marc-145或HS，H细胞，用细胞营养液稀释成5X 10细胞/mL.Jm入PRRS美洲或欧洲标准苦苦.使其最终浓度为100TCID;o/25L.混合后接种96孔细胞培养板l、2、4、5、7、8、10、113 GBI18090一200011列的各孔内，每孔加
39、100L，在3、6、9、12列的各孔内加100L未感染病毒细胞悬液(参照阁1)。把细胞培养板放在37C、5%CO，培养箱中培养48h72 h。当细胞出现20%CPE时，弃去培养液，用PBS液(100LI孔)洗一次，每孔加80%丙隅水溶液100L.把板置于4C条件下固定30min Q弃去丙酬液，在纸巾上拍f，放置室温下完全干燥后70C保存备用。B7 IFA诊断板的制备用细胞分散液消化Marc-145或HS，H细胞，用细胞营养液稀释成5X 10细胞ImL.加入PRRS标准毒，使其最终浓度为100TCID50125L.加到96孔细胞培养板的1、2、4、5、7、8、10、11列各孔内，每孔100L，在
40、3、6、9、12列各孔内加入未感染病毒细胞悬液100L(参照图1)。将该细胞培养板置37C、5%二氧化碳培养箱中培养60h68 h。弃去培养液，每孔加入预冷的无水乙醇100L，将此细胞培养板置于20C或70C冰箱中备用。附录C(标准的附录)猪繁殖和呼吸综合症病毒TCID5o;定C1 材料准备C1.1 器材:孔细胞培养板2块、微量移液器、恒温箱、倒置显微镜等。C1.2 病毒美洲型标准株ATCCVR-2332或欧洲型标准株LV.向农业部指定单位索取。C1.3 细胞2MARC-145或HS2H传代细胞，向农业部指定单位索取。使用时，细胞经细胞分散液消化分散后计数，用EMEM营养液(含楼牛血清10%、
41、青霉素100lU/mL、链霉素100问ImL，pH7.2)稀释至10细胞ImL，c2 操作方法C2.1 稀释病毒:取洁净无菌的48孔细胞培养板，于第1于1加EMEM营养液200L，其余各孔加225L;换吸头，再于排头第1孔添加病毒液50L.将混合液充分混匀。换吸头，吸取25L移于第2孔，混合。更换吸头，再吸取25L加入第3孔。连续如此操作至第10列，作成10个连续10倍的稀释液，使病毒稀释度依次为5X10 , 5 X 10、5X 10、5X 103、5X10、5X105、5X10、5X10、5X 10、5X10。改用多头微量取样器吸取每稀释度的病毒液50L移入另一块48孔(或96孔)细胞培养板
42、，每个稀辞度的病毒液平行移种4孔。剩下的各孔加50LEMEM营养液，留作细胞对照。C2.2 添加细胞:于细胞培养板各孔内添加50L工作浓度的细胞悬液。此时，病毒稀释度依次变为10、10、10、10、105、10、10、10、10、10100c2.3 培养:封板后，放37C5%二氧化碳保I恒温箱内培养。c3观察与TCID50计算在倒琶显微镜下逐孔观察致细胞病变作用(CPE)。每天观察一次，并将观察结果记入专用登记表内。观察天数为直至出现CPE终点，即看到能够引起病毒增殖的病毒最高稀释度。对照细胞应始终保持良好形态和特征。用Reed-Muench法、内插法或Karber法汁算该病毒培养物的TCID50/O.05 mL。1 1.1
