1、ICS 67. 100. 10 X 04 中华人民共和国国家标准GB/T 18980一2003乳和乳粉中黄曲霉毒素M1的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法Determination of aflatoxin M 1 content in milk and milk powder Cleanup by immunoaffinity chromatogaphy and determination by high-performance liquid chromatigraphy and f1 uorometer 2003-02-21发布中华国家OSO 14501:1998 ,IDT)
2、人民共和国监督检验检瘦总局2003-08-01实施发布381 GB/T 18980-2003 前言主F1=1 本标准的免疫亲和层析净化高效液相色谱法等同采用IS014501: 1998(乳和乳粉中黄曲霉毒素M，免疫亲和层析净化高效液相色谱法儿本标准免疫亲和层析净化一荧光光度法快速测定乳和军L粉中黄曲霉毒素M，, 本标准中的附录A为资料性附录。本标准由北京市质量技术监督局提出。本标准自全国食品工业标准化技术委员会归口。本标准起草单位z北京市产品质量监督检验所、青岛出入境检验检疫局、国家标准物质研究中心。本标准主要起草人z玉晶、张鹏、张艺兵、邵明武。本标准为首次发布。382 乳和军L粉中黄曲霉毒素
3、M1的测定免瘟亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法1 免瘦亲和层析净化高效液相色谱法1. 1 范围GB/T 18980-2003 本标准适用于乳、乳粉，以及低脂乳、脱脂乳、低脂乳粉和脱脂乳粉中黄曲霉毒素M，含量的测定。乳粉中的最低检测限是O.08g/kg，乳中的最低检测限是0.008g/L，1 2 术语和定义下班IJ术语和定义适用于本标准。12. 1 黄曲霉霉素M，含量anatoxin M, content 通过本标准所测定出的本物质的质量含量。注:黄曲霉毒素M，的啻量以微克/升(g/L)或微克/千克(Ig/kg)表示。1. 3 原理试样通过免疫亲和桩时，黄曲霉毒素M，被提取。亲和柱内含有的
4、黄曲霉毒素M，特异性单克隆抗体交联在固体支持物上，当样品通过亲和柱时，抗体选择性的与黄曲霉毒素M，(抗原)键合，形成抗体-抗原复合体。用水洗柱除去柱内杂质，然后用洗脱剂洗脱吸附在柱上的黄曲霉毒素M，收集洗脱液。用带有荧光检测器的高效液相色谱仪测定洗脱液中黄曲霉毒素M，含量。14 试剂除非特别声明，所用试剂为分析纯;使用蒸馆水、去离子水或其他相当纯度的水。1 4. 1 免疫亲和柱z应该含有黄曲霉毒素M，的抗体。亲和柱的最大容量不小于100ng黄曲霉毒素M , (相当于50mL浓度为2月/L的试样)，当标准溶液含有4ng黄曲霉毒素M，(相当于50mL浓度为80 ng/L的试样)时回收率不低于80%
5、。应该定期检查亲和柱的柱效和回收率，对于每个批次的亲和校至少检查一次(见1.4. 1. 1和1.4.1.2)。1. 4 1. 1 柱效检查用移液管0.5.4)移取1.0 mL的黄曲霉毒素M，储备液(1.4.5.2)到20mL的锥形试管中(1.5.9)。用恒流的氮气(1.4.3)将液体慢慢吹干，然后用10mL 10%的乙腊(1. 4. 2. 2)溶解残渣，用力摇荡。将该溶液加入到40mL的水中，充分混匀，全部通过免疫亲和牲。按说明书要求使用免疫亲和柱。淋洗免疫亲和柱后，洗脱下黄曲霉毒素M，。将洗脱液进行适当稀释后，用高效液相色谱仪测定免疫亲和柱键合的黄曲霉毒素M，含量。计算黄曲霉毒素M，的回收率
6、，将其结果与1.4. 1中所要求的指标进行比较。1.4.1.2 回收率检查用移液管(1.5.4)移取0.8mL O. 005g/mL的黄曲霉毒素M，标准工作液。.4.5.3)到10mL的水中，充分混匀，全部通过免疫亲和柱。按说明书使用免疫亲和柱。淋洗免疫亲和柱，洗脱下黄曲霉毒素M，。将洗脱液进行适当稀释后，用高效液相色谱仪测定免疫亲和柱键合的黄曲霉毒素M，含量。计383 GB/T 18980-2003 算黄曲霉毒素M，的回收率，将其结果与1.4. 1中所要求的指标进行对比。,. 4. 2 乙腊色谱级。1.4.2.125%乙麟水溶液z将250mL的乙赌(1.4.2)与750mL的水混溶(使用前需
7、要脱气)。1. 4. 2. 2 10%乙脯水溶液z将100mL的乙腊(1.4. 2)与900mL的水混溶(使用前需要脱气)。1. 4. 3 氮气。1. 4. 4 三氯甲炕g加人0.5%1.0%质量比(与三氯甲烧质量比的乙醇进行稳定。,. 4. 5 黄曲霉毒素M，标准榕液1.4.5.1 校准溶液黄曲霉毒素M，三氯甲烧溶液标称浓度为10月ImL.根据下丽的方法，在最大吸收波段处测定溶液的吸光度，以确定黄曲霉毒素M，的实际浓度。用分光光度计(1.5.11)在340nm-370 nm处测定，扣除三氯甲烧的空白本底，读取标准溶液的吸光度值。在接近360nm最大吸收波段，处，测得吸光度值为A.根据式。)计
8、算出浓度值Ci (g/mL)。ci=AXMX1001. . C 1 ) 式中=A一在).处测得的吸光度值;M一一328g/mol.黄曲霉毒素M，摩尔质量，单位为克每摩尔(g/moll; -1995 .溶于三氯甲烧中的黄曲霉毒素M，的吸光系数，单位为平方米每摩尔CmImoD. 1. 4.5.2 标准储备液确定黄曲霉霉素M，标准溶液的实际浓度值后(1.4.5.门，继续用三氯甲烧将其稀释至浓度为O. 1g/mL的储备液。储备液密封后于冰箱中5C以下避光保存。在此条件下，储备液可以稳定两个月.两个月后，应该对储备液的稳定性进行核查.1.4.5.3 黄曲霉毒素M，标准工作液从冰箱中取出储备液(1.4.5
9、.2)放置至室温，移取定量的储备液进行稀释制备成工作液。工作液当天使用当夭制备。黄曲霉毒素M，标准工作液配和g:用移液管(1.5.4)准确移取1.0 mL的储备液(1.4. 5. 2)到20mL 的锥形试管中0.5.9).用和缓的氮气(1.4.3)将溶液吹干，然后用20.0mL 10%的乙腊0.4.2.2)将残渣重新溶解，30min内振摇、混匀，配成浓度为0.005g/mL的黄曲霉毒素M，标准工作液。在用氯气对储备液吹干的过程中，一定要仔细操作，不能让温度降低太多而出现绪露。在作标准曲线时，黄曲霉毒素M，的进样量分别为0.05ng、O.1 ng、0.2ng和0.4ng.根据高效液相色谱仪进样环
10、的容积量，用工作液配制一系列适当浓度的黄曲霉毒素M，标准溶液，稀释液用10%乙脯0.4.2.2)。1. 5 仪幡及材料使用实验室通用仪器设备，特殊仪器及材料说明如下。1. 5. 1 一次性注射器.10mL和50mL。1. 5. 2 真空系统。1. 5. 3 离心机:4000 g离心力(离心力g=1.12X10-X转/分旋转半径)。1. 5. 4 移液管:1. 0 mL、2.0mL和50.0mL。1. 5. 5 玻璃烧杯:250mL. 1. 5. 6 容量瓶:100 mL。1. 5. 7 水浴g温控30C土2C.50C土20C，温度范围35C-37C。1. 5. 8 滤纸。1. 5. 9 带刻度
11、的磨口锥形玻璃试管:5mL.10 mL、20mL。1. 5. 10 高效液相色谱仪384 G/T 18980-2003 1.5.10.1 元脉冲泵z适合恒定体积流量约1mL/min的泵。1. 5.10.2 进样系统=具有固定或可变容积的进样环，进样体积50L500Lo1.5.10.3 反相色谱柱2填充3m或者5m的十八烧基硅胶，加有填充反相材料的保护柱。1. 5.10.4 荧光检测器具有365nm激发波长、435nm发射波长，在适当的色谱条件下能够测定。.02吨的黄曲霉毒素M，(相当于5倍噪音)。1. 5. 10. 5 记录仪z带打印机或绘图仪、电子积分仪或计算机数据处理系统。1. 5 11
12、分光光度计波长范围为200nm400 nm，带光径长度为lcm的石英比色池。1. 5. 12天平准确至O.1 g，最小分度0.01go 1. 6 采样采样方法不属于本标准叙述的范围，推荐的采样方法请参见r50707IJ。实验室收到的样品应该具有真正的代表性，在运输和储藏的过程中没有被损坏和改变。1. 7 分析步骤1. 7. 1 概述所有的操作分析均应尽可能在避光条件下进行。使用不同厂商的亲和柱，在乳粉的制作、洗涤和洗脱的操作方面可能略有不同，应该严格按照说明书要求进行操作。通常的分析步骤包括:用水或者盐水缓冲液将乳粉冲制成乳，离心分离后在一定压力过柱(可能需要预洗)，用水洗柱，并用甲醇或乙腊洗
13、脱吸附在柱上黄翩霉毒素M10严格按照规定的流速进行操作。1. 7. 2 制备试样1.7.2.1乳将乳样品在水浴(1.5. 7)中加热到35C37C。用滤纸(1.5.8)过滤(根据情况，也许需要用几张滤纸进行过滤)，或者在4000g离心力下离心15mino至少收集50mL乳试样，按照1.7. 4继续进行分析。1. 7.2.2 乳粉称取10g样品(精确到O.1 g) ，置于250mL的烧杯(1.5. 5)中。将50mL己预热jIJ50 c的水多次少量地加入到乳粉中，用搅拌棒将其混合均匀。如果乳粉不能完全溶解，将烧杯在50C的水浴(1.5.7)中放置至少30min，仔细混匀。将溶解的乳粉冷却至20C
14、后，移人100mL容量瓶(1.5. 6)中，用少量的水分次淋洗烧杯，淋洗液一并移人容量瓶中，再用水定容至刻度。用滤纸(1.5.的过滤乳，或者在4000g离心力下离心15mino 至少收集50mL的乳试样，按照1.7. 4继续进行分析。1. 7. 3 免瘦亲和柱的准备将一次性的50mL注射器筒(1.5.1)与亲和桂(1.4.)的顶部相连，再将亲和柱与真空系统(1.5.2)连接起来。1. 7. 4 样晶的提取与纯化用移液管移取50mL试样(1.7.2.1或1.7.2.2)到50mL注射器(1.5.1)中，调节真空系统(1. 5.幻，控制试样以2mL/min3 mL/min稳定的流速过柱。取下50m
15、L的注射器，装上10mL注射器。注射器内加入10mL水，以稳定的流速洗柱，然后，抽干亲和柱。脱开真空系统，装上另一个10mL注射器，加入4mL乙脯0.4.2)。缓缓推动注射器栓塞，通过柱塞控制流速，洗脱黄曲霉毒素M1，洗脱液收集在锥形管(1.5.9)中，洗脱时间不少于60s。然后用和缓的氮气(.4. 3)在30C下将洗脱液蒸发至体积V，为50L500L(警告如果蒸发至干，会损失黄曲霉毒素M，)。用水将V.稀释10倍至最终体积为V，(即500L5000L)。注:如果注人高效液相色谱仪吉黄曲霉毒素M，的样品，乙脯吉量超过10%.色谱峰变宽。如果在吉量超过90%, 则对色谱峰的形状没有影响。385
16、GB/T 18980-2003 1. 7. 5 高效液相色谱分析仪1.7.5.1泵以制定流速将乙精水溶液(1.4.2.1)泵流通过高效液相色谱柱。如果需要(根据所用包谱柱的型号)，调整乙脯一水的比例，以保证使黄曲霉毒素Mr与其他成分的分离效果最佳。乙脯水溶液(1.4. 2.1)的体积流速根据所用色谱柱0.5.10.3)而定。对于普通色谱柱(柱长约25 cm、科内径约4.6mm)而言.流速在1mL/min左右，效果最好$柱内径为3mm时，流速在0.5mld/mtn左右，效果最好。为f确定最佳的色谱条件，最好先将不含黄曲霉毒素Mr的阴性样品提取液注入HPLC，然后再注人样品提取液与黄曲霉毒素Mr标
17、准溶液的混合液。1. 7. 5. 2 色谱性能标准曲线的线性度和色谱系统的稳定性需要经常检查，多次反复地注人固定量的黄曲霉毒素Mr标准榕液，直至获得稳定的峰面积和峰高。相邻两次峰面积和峰高的差异不得超过5%。黄曲霉毒素Mr的保留时间与温度有关，所以对测定系统的漂移需要补偿。每隔一段时间测定固定量的黄曲霉毒素Mr标准溶液，这些标准溶液的测定结果可以根据漂移的情况进行校正。1. 7.5.3 黄曲霉素Mr的标准曲线根据HPLC进样环容积，选择适当体积数V，分别注入含有O.05 ng、O.1 ng、O.2 ng和0.4ng的黄曲霉毒素Mr标准榕液。绘制成峰面积或峰高对黄曲霉毒素Mr质量数的标准曲线。1
18、 7.5.4 样品洗脱渡的色谱分析及进样方襄通过进样环将适量体积VI洗脱液注人高效液相色谱仪。采用与标准溶液相同的色谱条件分离出洗脱液中的黄曲霉毒素Mr。标准溶液和样品洗脱液均按照规定的方案进样。当连续检测一系列样品时，建议每隔五个样品，加测-个黄曲霉毒素Mr标准溶液。根据样品洗脱液色谱圈中黄曲霉毒素Mr的峰高或峰面积值，从标准曲线上得出样品洗脱液中所含有的黄曲霉毒素Mr质量数(ng)。如果样品洗脱液的黄曲霉毒素Mr的峰面积或峰高值高于标准溶液，用水定容稀释样品洗脱液后，重新进样分析。1. 8 测定结果的计算与表示1. 8. 1乳应用式(2)计算被测样品中的黄曲霉毒素Mr的含量WmoWm =
19、mA X (Vr/V.l x (! /V) 式中zWn -一黄曲霉毒素Mr的含量，单位为微克每升(g/L); . ( 2 ) m , 样品洗脱液黄曲霉毒素Mr的峰面积或峰高从标准曲线上得出的黄曲霉毒素Mr的质量数，单位为纳克(ng); vi 样品洗脱液的体积数，单位为微升(L); V ,-样品洗脱液的最终体积数，单位为微升(L); V 通过免疫亲和柱被测样品的体积数，单位为毫升(mL)0 计算结果表示到小数点后三位。1. 8. 2 乳粉应用式(3)计算被测样品中的黄曲霉毒素Mr的含量W，0 W , = mA X (V,/V,) X (11m) ( 3 ) 式中zuf 样品中的黄曲霉毒素Mr的含
20、量，单位为微克每千克(/lg/kg); m- - 50 mL样液(7.4)中所含有的乳粉质量数，单位为克(g)，386 mA、民、V;的含义与1.8. 1中所定义的一样。式(31适用于未经稀释的试样，否则应该乘以稀释倍数。计算结果表示到小数点后三位。1. 9 精密度GB/T 18980-2003 各实验室试验结果的精密度总结于附录A中，这些数据不适用于其他的浓度范围和材质。1. 10 测试报告测试报告中应该含有.a) 描述样品完整特征所需要的所有信息gb) 采样方法，如果知道请写上p。根据该标准，所采用的试验方法;d) 该标准没有提出的其他操作细节，对测试结果可能产生影响的操作、现象以及采取的
21、措施ge) 测试结果g。如果检查了重复性，最终的验证结果。2 免瘦奈和层析净化荧光光度法2. 1 范围本方法规定了用免疫亲和层析净化荧光光度法测定乳和乳粉中黄曲霉毒素M1的条件和详细分析步骤。本方法适用于乳和乳粉中黄曲霉毒素M1的快速测定。乳中黄曲霉毒素M1的检出限为O. 1g/L，乳粉中黄曲霉毒素M1的检出限为O.1g/kgo 2.2 方法提要试样经过离心、脱脂、过滤后，滤液经过含有黄曲霉毒素M1特异性单克隆抗体的免疫亲和层析净化，黄曲霉毒素M1交联在层析介质中的抗体上。此抗体对黄曲霉毒素M1具有专性，当样品通过亲和柱时，抗体选择性的与所有存在的黄曲霉毒素M1(抗原)键合。用甲醇一水(10十
22、90)将免疫亲和柱上杂质除去，以甲醇-水(80+20)通过免疫亲和柱洗脱，加入澳溶液衍生后的洗脱液于荧光光度计中测定黄曲霉毒素M1含量。2 3试1111除非另有规定，仅使用分析纯试剂、重蒸馆水。2. 3. 1 甲醇(CH30H):色谱纯。2.3.2 氯化锵(NaCD。2. 3. 3 甲醇2 3. 4 .甲醇7水(80+2刽0):取80mL甲醉加入20mL水。2.3.5 澳溶液储备液(0.01%):称取适量澳，溶于水后，配成0.01%的储备液，避光保存。2. 3. 6 澳溶液工作液(0.002 %) :取10mL O. 01 %的澳溶液加人40mL水混匀，于棕色瓶中保存备用。现用现配。2. 3.
23、 7 二水硫酸奎宁已。HN，02 H2SO, 2H20)。238 硫酸溶液(0.05 mol/L) :取2.8mL浓硫酸，缓慢加入适量水中，冷却后定容至1000 mL。2. 3. 9 荧光光度计校准溶液2称取O.340 g硫酸奎宁(C20HN20， H2SO, .2H20)，用0.05mol/L 硫酸溶液溶解并定容至100mL，此溶液荧光光度t读数相当于2.0g/L黄曲霉毒素M1标准溶液。0.05 mol/L硫酸溶液荧光光度计读数相当于0.0吨/L黄曲霉毒素M102. 4 仪器2. 4. 1 荧光光度计。2. 4. 2 离心机.离心力不低于4000r/mino 387 、GB/T 1日980-
24、20032. 4. 3 玻璃纤维滤纸z直径11cm，孔径1.5mo2.4.4 黄曲霉毒素M1免疫亲和柱。2.4.5 空气压力泵。2.4.6 玻璃试管z直径12mm.长75mm，无荧光特性。2.4.7 玻璃注射棒。2.5 分析步骤2. 5. 1 样晶提取2.5.1.1乳取50mL乳样品，加入1.0g氯化钩.4000r/min离心力下离心10min./j、心移取用于分析的乳底层脱脂部分，不要扰动顶部脂肪层，将脱脂的乳以玻璃纤维滤纸过滤，滤液备用。2. 5. 1. 2 乳粉称取5.0g乳粉，用30C 60C水将其慢慢溶解，定容为50mL，加入1.0 g氯化销，以下按2.5.1.1的步骤操作。2.5.
25、2 净化将免疫亲和柱连接于10mL玻璃注射器下.准确移取10.0mL上述滤液注入玻璃注射器中，将空气压力泵与注射器连接，调节压力使溶液以约6mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2mL3 mL 空气通过柱体.以10mL甲醇-水(10+90)清洗柱子两次，弃去全部流出液，并使2mL3 mL空气通过柱体。准确加入1.0 mL(V1)甲醇水(80+20)洗脱液洗脱，流速为1mL/min2 mL/min，收集全部甲醇-水洗脱液于玻璃试管中，备用。2.5.3 测定2. 5. 3. 1 荧光光度计枝准在激发波长360nm，发射波长450nm条件下，以0.05mol!L硫酸溶液为空白，调节荧光光度计的读数
26、值为O.。g/L，以荧光光度计校准溶液调节荧光光度计的读数值为2.。g/Lo2.5.3.2 样液测定取上述洗脱液加入1.0 mL(V)O. 002 %澳溶液，1min后立即予荧光光度计测定样液中黄曲霉毒素M1含量Co2.5.3.3 空白试验用水代替试样，按2.5. 12. 5. 3步骤做空白试验。2. 6 结果计算2. 6. 1乳乳检测结果按式(4)计算.式中=X , = C1 - co) X V 1 X 10 . V X1一试样中黄曲霉毒素M1含量，单位为微克每升(g/L), C1-荧光光度计中读取的样液中黄曲霉毒素M1的浓度，单位为微克每升(g/L)，.( 4 ) Co荧光光度计中读取的空
27、白试验中黄曲霉毒素M1的浓度，单位为微克每升(g/L), V1一最终净化甲醇水洗脱液体坝，单位为毫升(mL), V 通过亲和柱试样体积，单位为毫升(mL), 10 仪器的读数系数。计算结果表示到小数点后一位。388 GB/T 18980-2003 2.6.2 乳粉乳粉检测结果按式(5)计算z式中sX , = (C2 - co) X V) X 1。二-4mxv X2-一-试样中黄曲霉毒素M)含量，单位为微克每千克仰自/kg)，C2一-荧光光度计中读取的样液中黄曲霉毒素M)的浓度，单位为微克每升(用/L), c，-荧光光度计中读取的空白试验中黄曲霉毒素矶的浓度，单位为微克每升(g/L), V)-最
28、终净化甲蹲-水洗脱被体积，单位为毫升(mL); V-通过亲和校试样体积，单位为毫升(mL); m二50mL试样中所含乳粉的质量数，单位为克每毫升(g/mL); 10-】仪器的读数系数。计算结果表示到小数点后一位。389 . ( 5 ) GB/T 18980-2003 附录A(资料性附录)多个不同实验室的试验结果tll:界各地16个实验室参加了低脂肪0%)和高脂肪(28%)乳粉样品的协同试验。离脂肪样品是用于制作参比物质的剩留物4J，所以黄曲霉毒素Mj的含量是已知的。对于乳粉，其污染水平为0.08g/kgO.6g/阔，即对于乳而言，污染水平为8ng/L60 ng/L。试验结果根据ISO5725-
29、)和ISO5725-22，3J规定的统计方法获得，其精密度的数据列于表A.) (注:试验数据来自于参考文献5J和6J)。表A.1 精密度数据样品编号1 2 3 4 5 实验室于数细12 4 13 11 14 平均值/(ng/kg)81 150 80 202 580 重复性值r!(ng/kgJ23 60. 1 15 27 203 再现性值R!(ng!kg)52 98 41 61 310 重复性变异矗数!(%J 9. 9 14.0 6. 8 4. 7 12. 5 重验性J)异革数/(%J 23 22. 7 18. 3 10. 8 19. 1 a 减少的实验室数是根据Cochran和Grubbs统计
30、方法应该从样本中剔除的数据。390 GB/T 18980 2003 参考文献L 1 J ISO 707 ,1997. Milk and milk products-Guidance on sampling. 2J ISO 5725-1 ,! 994.Accuracy (trueness and precision) 01 measurement method只andrcsults-Part 1.General principles and definitions. :J ISO 5725-2: 994 , Accuracy (trueness and precision) of measure
31、ment methods and results -Part 2: Basc method for the dctcrmination of repeatability and reproducibility of a standard measure ment method. 4J Commission of the European Community. Community Bureau of Reference , BCR. The certifica tion 01 aflatoxin M, in three milk powder samples. CRM No. 282.284.285. Van Egmond H. P and Wagstaffe P. J. ,Report a.nd Addendum re户。时，EUR10412.1986. s IDF collaborative stucly on the determination of aflatoxin M1 in milk powder, using immunoaffin ity columns. L. G. M. T. Tuinstra.Roos A. HM P.电J.A.O. A. C. lnt、993、76(6)，pp.1248-254. 391
