1、ICS 65. 150 B 52 喧嚣中华人民共和国国家标准牛Bull frog 蛙GB/T 19163-2010 代替GB19163-2003 2011-01-10发布2011-06-01实施数码防伪中华人民共和国国家质量监督检验检瘦总局中国国家标准化管理委员会发布GBjT 19163-2010 前言本标准代替GB19163-2003(牛蛙。本标准与GB19163一2003相比主要变化如下:标准性质改为推荐性;增加了牛蛙年龄鉴定方法;一一增加了引用标准GBjT18654. 1、GBjT18654.2、GBjT18654. 12、GBjT25884; 一一删除了原标准的附录A。本标准的附录A为
2、规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国水产标准化技术委员会淡水养殖分技术委员会归口。本标准起草单位:湖南农业大学、湖南生物机电学院。本标准主要起草人:王晓清、王宇、肖克宇、何湘蓉、詹炜。本标准所代替标准的历次版本发布情况为z一GB19163-20030 I GB/T 19163-2010 牛蛙1 范围本标准确立了牛蛙CRanactesbeiana Shaw)的名称与分类、主要形态构造特征、生长与繁殖、遗传学特性、检测方法及结果判断。本标准适用于牛蛙的种质检测与鉴定。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单
3、(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 18654. 1 养撞鱼类种质检验第1部分:检验规则GB/T 18654. 2 养殖鱼类种质检验第2部分z抽样方法GB/T 18654. 12 养殖鱼类种质检验第12部分:染色体组型分析GB/T 25884 蛙类形态性状测定3 术语和定义GB/T 25884确立的术语和定义适用于本标准。4 名称与分类4. 1 学名牛蛙CRanacatesbeiana Shaw)。4.2 分类地位元尾目CAnura)、蛙科CRanidae)、
4、蛙属CRana)。5 主要形态构造特征5. 1 外部形态特征5. 1. 1 外形身体粗短，头部宽而扁，略呈三角形，1对圆形鼓膜位于眼后方，鼓膜颜色与头部背面颜色基本一致，沿眼后到鼓膜上方有明显的皮肤裙。皮肤较光滑，背部略显粗糙，有极微细的肤棱。前肢4指，元躁，指序为E、I、町、田，雄蛙第一指内侧有发达的婚垫，生殖季节显著增大，雌蛙没有婚垫;后肢特别发达，5趾，全躁，躁不完全达趾端，趾序为I、E、V、皿、凹。体色随栖息环境、年龄、性别、营养状况而异。通常头部为绿色，背部为绿褐色、黄褐色或黑褐色，有深浅不一的不规则状斑块或斑纹，腹部为灰白色，有暗灰色斑纹。成熟雄蛙下顿部为金黄色，雌蛙则与腹部颜色一
5、致。牛蛙外部形态见图1。1 GB/T 19163-2010 背面观腹面现图1牛蛙外形(含)5. 1. 2 可量性状对于体长10.3 cm16. 1 cm，体重175.2 g548. 7 g的牛蛙，实测性状比例值见表1。性别体长/头长 3.093土0.217合2.981士0.2435.2 内部构造特征5.2. 1 声罢头宽/头长1. 162土0.0961. 168士0.089表1实测可量性状比例值鼓膜径/眼径后肢长/体长0.942土0.0981.167土0.0781. 338土O.151 1. 475士0.102雄蛙咽部有1对内声囊，开口于口口同腔;雌蛙x声囊。5.2.2 脊椎N趾长/足长/前臂
6、长N-V趾臻宽1. 609士0.1191. 770士0.2421. 613土0.1151. 708士0.244颈椎骨1枚、躯椎骨7枚、荐椎骨1枚、尾杆骨1枚。属前凹后凸的参差型椎体。5.2.3 生殖系统成熟雄体有一对浅黄色卵圆形的精巢，保留有退化状态的缪勒民管。成熟雌体有一对囊状结构的卵巢，卵巢内含有淡黄色的早期卵和动物极为黑色、植物极为乳白色的成熟卵或接近成熟卵。生殖腺的前方各有一个指状脂肪体，性成熟前为白色或淡黄色，性成熟后为黄色，大小随季节及营养状况等因素变化。6 生长与繁殖6. 1 生长养殖条件下牛蛙体长、体重的实测值见表20表2养殖条件下牛蛙的体长、体重实测值4.63士7.21士10
7、.20土12.24土13.47土14.33土14.96士15.58士16.15士体长/cm0.47 0.28 0.39 0.29 0.35 0.42 0.52 0.31 0.43 11. 09土42.43土115. 73土202.40士294.45士373.82土44 1. 32士500.84土546.55土体重/g0.80 4.61 15.02 17.56 17.77 21. 15 28.26 34. 13 38.97 2 GB/T 19163-2010 6.2 繁殖6.2.1 性成熟年龄性成熟年龄为2龄。6.2.2 产卵季节北方地区为5月份8月份，湖南、湖北等省为4月份9月份，广东、福建等
8、省为3月份ll月份，适宜产卵水温20oc 30 oc。6.2.3 产卵次数与类型性成熟雌蛙每年可产卵1次2次，并以春季产卵为主。卵球形，卵径1.2 mm1. 5 mm，动物极深黑色，植物极乳白色，产出的卵外包肢质膜，相互粘连成单层或团状卵块。6.2.4 怀卵量性成熟雌蛙生殖季节卵巢系数为12.6%27. 6%，绝对怀卵量(5.0士O.77) X 104粒，相对怀卵量。06.7土8.69)粒/g。7 遗传学特性7. 1 细胞遗传学特性牛蛙体细胞染色体数:2n=26，臂数CNF):S2，核型公式:2n二22m十4sm。牛蛙染色体组型见图20也百后毛2气x民:江民?气只凡.x x x 飞飞;已图2牛
9、蛙染色体组型图7.2 生化遗传学特性牛蛙心肌的乳酸脱氨酶(LDH)同工酶I包泳酶谱见图3，酶带扫描图见图4。+ 飞10m 一图3牛蛙心肌LDH同工酶电泳酶谱8 检测方法图4牛蛙心肌LDH同工酶酶带扫描固8. 1 抽样按GB/T18654.2的规定执行。3 GB/T 19163-2010 8.2 年龄鉴定8.2.1 取样剪取牛蛙第2趾骨，清洗晾干。8.2.2 操作步骤将材料放入80%乙醇中硬化10h15 h，在3%硝酸溶液中脱钙24h左右，使其软化，然后按常规石蜡切片方法制片。8.2.3 观察年龄在显微镜(10x 20)下可观察到黑色狭窄带与淡红色宽带间隔的排列，黑色带即为年轮标志，1个年轮记为
10、1龄，2个年轮记为2龄，依此类推。8.3 生物学性状测定按GB/T25884的规定执行。8.4 繁殖力的测定在繁殖季节，解剖未产卵的雌亲蛙，取出卵巢，用电子秤称重，再称取1.0g卵，2个样品，分别计数每克卵的平均卵粒数。卵巢中所含的全部卵粒数即为绝对怀卵量，单位体重(g)所含的卵粒数为相对怀卵量。8.5 染色体的测定8.5.1 标本制备术前8h12 h腹腔注射质量分数为0.1%的植物血凝聚素CPHA)O.5 mLl. 0 mL(每100g体重)，术前4h6 h腹腔注射秋水仙素溶液(每克体重10吨15g);解剖牛蛙，从股骨和腔骨中取骨髓放入质量分数为0.4%的氯化饵(KC!)溶液中，37.C水浴
11、15min20 min。以1000 r/min离心10 min，弃其上清液，加1mL固定液(甲醇z冰乙酸为3:1)，4.C条件下固定20min，重复固定2次。再加少量固定液，制取细胞悬液;取细胞悬液滴片，在酒精灯上文火烘干，浸没在吉姆萨(Giemsa)工作液(配制按GB/T18654. 12的规定执行)中染色30min，用蒸馆水冲去多余染液，空气干燥制片。8.5.2 染色体计数和组型分析按GB/T18654. 12的规定执行。8.6 生化遗传分析8.6.1 试样的制备与保存解剖牛蛙，取心肌，用生理盐水洗去血液后称重、切碎，按质量体积比1: 5加生理盐水低温匀浆，4.C条件下以12000 r/m
12、in离心10min。取上清液加入等量40%的蔚糖溶液，摇匀后作好标记置于一25.C冰箱中保存。8.6.2 电泳分离用水平平板电泳仪及质量分数为6%的聚丙烯眈胶凝胶电泳分离，用澳酣蓝作指示剂。加样前，50 mA预电泳30min;加样后，稳压280V，电泳80min90 min，至澳酣蓝到达距胶前沿1cm处停止。8.6.3 染色固定电泳结束后，取凝胶放入预先配好的染色液中，37.C温浴10min30 min，至条带清晰，倾出染色液，用固定液(按甲醇=乙酸=水的体积比为45: 12 : 43配制)终止反应。同工酶染色液配制见附录A。8.6.4 扫描测定用激光扫描仪对电泳图谱进行扫描分析。9 结果判断
13、按GB/T18654. 1的规定执行。4 GB/T 19163-2010 附录A(规范性附录)同工酶染色液的配制.1 磷酸盐缓冲液(0.5mol/L)的配制取磷酸二氢饵(KH2P04)6.8g溶于约80mL蒸馆水中，以氢氧化铀(NaOH)溶液(2mol/L)调节pH至7.4，再用蒸馆水定容至100mL。.2 氧化硝基四氨瞠蓝(NBT)贮液(mg/mL)的配制取50mg氯化硝基四氮瞠蓝(NBT)定容于50mL蒸馆水中，40C保存。.3 辅酶1(NAD)贮擅(mg/mL)的配制取100mg辅酶1(NAD)定容于10mL蒸馆水中。.4 盼晤甲醋硫酸盐(PMS)贮液(mg/mL)的配制取50mg吩嗦甲
14、醋硫酸盐(PMS)定容于50mL蒸馆水中，4oC暗处保存。.5 氧化铀(NaCI)溶溜(0.1mol/L)的配制取氧化铀584mg定容于100mL蒸馆水中。.6 每化镜(MgCI2)溶液(0.005mol/L)的配制取氯化镇(MgC12 6H20)100 mg定容于100r此蒸馆水中。.7 乳酸纳溶液(1moI/L)的配制取DL-乳酸铀9.35mL(浓度600mg/mL)加蒸锢水至50mL。.8 染色液的配制取磷酸盐缓冲液(A.1) 7. 5 mL，加氯化硝基四氮瞠蓝溶液(A.2) 7. 5 mL、辅酶I溶液(A.3)3.0 mL、盼嗦甲醋硫酸盐溶液(A.4)0.75 mL、氧化铀溶液(A.5
15、)3. 0 mL、氯化娱溶液(A.6)3. 0 mL、乳酸铀溶液(A.7)3. 0 mL，混匀即成。5 OFONi的FEHg国华人民共和国家标准牛蛙GB/T 19163-2010 中* 中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045 网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销给印张o.75 字数11千字2011年2月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2011年2月第一版，峰书号:155066. 1-41592 16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533定价G8/T 19163-2010 打印日期:2011年3月20RF002A
