1、GB/T 19167-2003 前言传染性囊病OBD)又名鸡传染性法氏囊病、腔上囊炎、甘布罗病，是由双RNA病毒科禽双RNA病毒属的传染性囊病病毒(IBDV)引起的鸡和火鸡的-种急性、高度接触传染性疫病。本标准参考了世界动物卫生组织WorldOrganization for Animal Health(英), Office International des Epizooties(法)，OIE的哺乳动物、禽、蜜蜂A和B类疾病诊断试验和疫苗标准手册所推荐的方法。本标准的附录A为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口，本标准由北京市农林科学院畜牧兽医
2、研究所负责起草，由广西兽医研究所协作起草。本标准主要起草人z为j有昌、刘离、周蚊、姚炜光、张方亮、贺荣莲、吴健敏、兰美益、黄红梅、蒋冬福、韦志锋。I GB/T 19167-2003 传染性囊病诊断技术1 范固本标准规定了传染性囊病病毒的病原分离、抗原的检测和检测特异性抗体的琼脂凝胶免疫扩散试验、病毒血清微量中和试验、酶联兔疫吸附试验的技术要求。本标准适用于传染性囊病的诊断与检疫.2 病毒的分离及其鉴定2. 1 材料准备灭菌组织研磨器、离心机、37C温箱、孵化器、灭菌吸管、橡胶吸头、灭菌小瓶、灭茵俨针头、灭菌注射器、石蜡。2.2 病料的采集和处理采集具有病变的新鲜法氏囊，用加有抗生素(3000I
3、U/mL青霉素和3000g/mL链霉素)的膜蛋白酶磷酸缓冲液或生理盐水和j成20%的组织匀浆液，在37C作用30min60 min. 1 500 r/min离心20 min，收集上清液。经菌检培养为阴性后作为接种材料。2.3 鸡胚接种2. 3. 1 接种将收集的上清液以每只0.2mL的量经绒毛尿囊膜接种9日龄ll日龄无传染性囊病母源抗体鸡胚或SPF鸡胚(无特定病原体鸡胚).接种后用石蜡封住接种孔。37C孵育，每天照蛋检查，弃去24h内死亡的鸡胚。2.3.2 鸡胚膏j输结果判定2.3.2. 1 标准IBDV分离物接种后判定标准的IBDV分离物接种鸡胚后3d5d可致鸡胚死亡。死亡鸡胚充血，在羽毛囊
4、、趾关节和大脑有血斑性出血。肝脏多可见坏死，也可见色淡似熟肉样。2. 3. 2. 2 IBDV变异株分离物接种后判定:IBDV变异株经绒毛尿囊膜接种鸡胚，一般不致死鸡胚，接种后5d6 d !lJ检，可见鸡胚大脑和腹部皮下水肿、发育迟缓、呈灰白色或奶油色，肝脏常有胆汁着色或坏死，脾脏通常肿大2倍3倍，但颜色无明显变化。2.4 易感雏鸡接种试验2. 4. 1 接种取2.2述及的病料上清液0.5mL.经点眼、口服感染5只14日龄21日龄无IBDV母源抗体鸡或SPF鸡。同时设健康对照组。接种3d后将鸡剖杀，检查法氏囊及脾脏。2.4.2 剖检接种结果2.4.2.1 标准IBDV接种结果z接种后偶见鸡死亡
5、，剖检可见接种鸡法氏囊水肿、色黄，有时可见出血。脾脏有时可见轻度肿大，表团有灰色点状病变。健康鸡则正常。2. 4. 2. 2 IBDV变异株接种结果z接种后不出现死亡.3d!lJ检可见法氏囊萎缩、质度硬，脾脏可见肿大l倍2倍。健康鸡则正常。2.5 IBD病毒的鉴定2.5. 1 琼脂凝胶免疫扩散(AGID)试验用已知的特异性的鸡传染性囊病标准阳性血清，用分离株的法氏囊匀浆制备待检抗原，同时制备正常法氏囊匀浆作对照抗原，按AGID常规法滴加抗原和血清进行扩散，如在抗原孔和血清孔之间出现白色沉淀线者判分离物为阳性。1 GB/T 19167-2003 2.5.2 直接免疫荧光法2. 5. 2. 1 材
6、料及方法2.5. 2. 1. 1 商免血清采用Cj801株毒制备的高免血清，经AGID测定效价为1 128以上，经中和试验测定在212(1 . 208 4)以上。2.5.2. 1. 2 直接荧光抗体的制备采用33%饱和硫酸镀盐析，沉淀免疫球蛋白，经透析并通过SephadexG50柱去镀离子，用紫外分光光度汁测定球蛋白浓度在20mg/mL-25 mg/mL左右，以异硫氢酸荧光素(FITC)按1%量采用热标记方法标记，再经透析和SephadexG50柱层析，收集荧光抗体，保存于20C冰箱备用。2. 5. 2. 1. 3 标本的制备及染色取分离株法氏囊制成冰冻切片或用其组织制成压片。待自然干燥，以4
7、C保存的冷丙嗣溶液固定10 min ,O. 1 mol/L pH7. 2磷酸盐缓冲液冲洗两次，蒸馆水冲洗一次，风于后用1 8-1 16荧光稀释液为工作液，滴加在切片上置湿盒中，在37C温箱中静置30mn，再经磷酸盐缓冲液、蒸馆水冲洗，风干，滴加甘泊缓冲液封固、镜检。2.5.2.2 镜检及判定标准用荧光显微镜检查。采用法氏囊冰冻切片为荧光诊断标本，法氏囊病毒侵害法氏囊后主要表现在淋巴小叶的髓质部。首先在淋巴滤胞胞浆中发出黄绿色荧光颗粒，胞核位于中间为暗色不发光。感染初期常见到光轮样结构的淋巴滤胞，感染最严重时由于大量病毒在泡浆中复制发出强荧光的亮斑。皮质不发光。具有上述淋巴图像称为特异性荧光，判
8、为阳性。根据荧光强弱，荧光细胞的数量及荧光结构的清晰度可判为十十+、+、十+、+。淋巴小叶结构完整而清晰，又不发荧光者判为阴性。3 琼脂凝胶免疫扩散3. 1 材料准备3. 1. 1 鸡传染性囊病诊断抗原和标准阳性血清。3. 1. 2 琼脂板制备方法见附录Ao3. 1. 3 被检血清样品=被检鸡血清应新鲜，分离后56C灭活30mn，采血后分离的血清可以当天使用，也可置200C保存备用。3.2 操作程序3.2. 1 打孔反应孔按画好的七孔图案打孔，将画好的七孔图案放在有琼脂板的平皿下，按照图案在固定位置用不锈钢小管打孔，中心孔径3mm，外周孔径3mm，外周孔与中间孔间距3mm，打于L时w下的琼脂可
9、以吸出也可以用针头挑出。打好后，在酒精灯上适当加热平皿底部，使琼脂与玻璃平皿贴紧，避免由于打孔时导致的琼脂与平皿脱离。3.2.2 加样3.2.2.1 抗体的定性与定量测定若是做定性试验，不需要稀释血清，只将血清样品直接加人琼脂板孔中g但若要定量测定血清沉淀抗体的滴度，可以在24孔或96孔V形培养板上稀释血清，各孔预先加入50L的PBS，然后倍比稀释血清，最后更换吸头由高稀释度开始加样。3.2.2.2 抗原及血清在孔内的添加如图I所示，中央孔7加抗原，1、4孔加阳性血清，2、3、5、6孔加被检血清，各孔加到孔满为止.如果定最检测血清的沉淀抗体，采用中央孔7加抗原，周围1-6孔依次加入各不同稀释度
10、的血清样品。在琼脂板上另做二孔，打法及间距同前，分别加人阳性血清和抗原，设立阳性对照。加盖将平皿置于湿盒或容器中，在370C条件下反应，逐日观察，72h终判。2 3.3 结果判定3. 3. 1 定性检测去。运。固1琼腼扩敝反应孔的布局GB/T 19167-2003 被检血清孔与抗原孔之间形成致密沉淀线者，或者阳性血清的沉淀线向毗邻的被检血清孔内侧弯者，此被检孔血清判为阳性。被检血清孔与抗原孔之间不形成沉淀线，此被检血清判为阴性.3.3.2 定量检测当标准阳性血清孔与抗原孔产生致密沉淀线后，被检血清能与抗原产生沉淀线的最高稀释度即为该被检血清的沉淀抗体效价。4 病毒血清微量中和试验4. 1 材料
11、4. 1. 1 器材240孔或96孔有盖的聚苯乙烯微量细胞培养板洗净后烘干，采用紫外线距离30cm照射盖内侧、培养板孔1h或射线辐射消毒。多道、单道固定或可调式微量取样器，规格为5L-50L、50L-200L.并配以相应规格经高压消毒的塑料吸头，2cm宽的涤纶透明胶带。4. 1. 2 细胞2鸡胚成纤维细胞。4. 1. 3 血清:IBDV阳性血清和阴性血清均由SPF鸡制备。被检血清为采自受检鸡的不腐败、不溶血、不加抗凝剂和防腐剂的血清，在试验前56C水浴灭活30min , 4.2 操作程序本试验采用两板法，即板1作血清病毒感作，板2用作正式试验。4.2. 1 取75LEarles液加到板1各孔，
12、第10列加75LEarles液作细胞对照。4.2.2 取25L被检血清分别加到A、B、C行的第1孔，分别作1: 4倍系列稀释至第8孔。4.2.3 取25L阳性血清加到D行的第1孔，取25L阴性血清加到D行的第5孔，分别按上法稀释(即1-4孔为阳性对照.5-8孔为阴性对照4.2.4 除第10列外，取25L含200TCID50/25L的C801病毒，然后置微量振荡器上振荡混匀，37C感作45min-60 min。4.2.5 用取样器以200L含100万/mL鸡胚成纤维细胞加到板2各孔内。4.2.6 用取样器分别吸取病毒血清混合物转移到板2相应各孔内，每份血清接种4孔，每孔25L。4.2.7 用2c
13、m宽的涤纶透明胶带封盏，振荡混匀，置37C温箱培养72h-96 h后，显微镜下观察细胞病变情况。4.3 结果判定1 : 8以下为阴性;1 : 32以上判为阳性;1 : 16判为可疑，隔周后采血测定抗体价仍为1: 16或更低则为阴性。5 酶联免疫吸附试验5. 1 鸡传染性法氏囊病病毒抗原的检测5. 1. 1 材料准备5. 1. 1.1 被检样品:送检的病、死鸡法氏囊。3 GB/T 19167-2003 5. 1. 1. 2 标准阴性样品g标准阴性样品为健康鸡法氏囊组织浸液。5. 1. 1. 3 MR5000酶标仪。5. 1. 2 操作琼辘100C 30C。5. 1. 3 操作程序5. 1. 3.
14、 1 被检样品的处理z将送检的病、死鸡法氏囊剪碎研磨，按1: 5量加自来水，制成组织浸液，静置5min，取上清液进行检测。5. 1. 3. 2 加样z用小塑料管(中5mm，长500mm)吸取上述被检法氏囊的组织浸液，加到聚苯乙烯酶标板的小孔内1滴(50L.以下同).每1个样品用1个孔，同时设1个孔作对照，用小塑料管吸取标准阴性样品，向对照孔内滴入1漓，静置2mino 5. 1. 3. 3 洗涤.再向加样的小孔内滴入洗液1滴之后，接着用自来水滴满小孔，洗2次，每次均充分甩于。5. 1. 3. 4 加酶结合物g向加样的小孔内滴人酶标记结合物1滴，静置2mino 5. 1. 3. 5 洗涤z同5.1
15、.3.3的方法，用自来水洗5次。5. 1. 3. 6 显色g向加样的小孔内滴入底物1滴，紧接着滴人显色液1滴，在5min内判定结果。5. 1. 4 结果判定5. 1. 4. 1 观察颜色的判定孔内的液体显蓝色者，判为阳性。孔内的液体呈无色者.j!lJ为阴性。5. 1. 4. 2 酶标仪检测的判定5.1.4.2.1 加终止液，加显色液后5min，用小塑料管吸取终止液，向加样的小孔内滴人1滴.用酶标仪测定00，的数值。5. 1. 4. 2. 2 判定000 =0.105 定为临界值.000 0. 105 判为阳性。000 00嗣0.105判为弱阳性。00,00. 4 国j为阴性.5 GB/T 19167-2003 附录A(规范性附录)琼脑摄胶的制备试验中琼脂ilitJ备方法为琼脂糖1g.氯化制8g.苯盼0.1mL.蒸馆水100mLo先将琼脂糖加到蒸馆水中，加热熔化后再加入氯化锅、苯盼，最后用5.6%碳酸氢销调pH值为6.87. 2.将溶化并混匀的琼脂缓慢倒入平放的清净的玻璃平皿中，平皿中琼脂厚度要求3mm，冷却凝固后备用。6
