1、前言本标准的附录A和附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局提出。本标准由中华全国供销合作总社归口。本标准起草单位:中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局。本标准主要起草人庞国芳、李学民、张进杰、曹彦忠、范春林、贾光群。本标准系首次发布的国家标准。GB/T 19427-2003 1 范围蜂胶中芦丁、杨梅酣、榈皮素、鼓菲醇、芹菜素、松属素、苛因、高良姜素含量的测定方法液相色谱-串联质谱检测法和液相色谱-紫外检测法GB/T 19427-2003 本标准规定了蜂胶中芦丁、杨梅酣、懈皮素、茨菲醇、芹菜素、松属素、苛因、高良姜素含量的液相色谱-串联质谱和液相色谱测定方法。本标准适用
2、于蜂胶中芦丁、杨梅嗣、懈皮素、王克菲醇、芹菜素、松属素、苛网、高良姜素含量的测定。本标准液相色谱串联质谱法的检出限芦丁为0.15g/kg;杨酶嗣为0.050g/kg;懈皮素、高良姜素为0.025岁kg;获菲醇、芹菜素、松属索、苛因为0.0060 g/kg。液相色谱法的检出限:杨梅酣、鼓菲醇、芹菜素、苛因为0.10g/kg;芦丁、懈皮素、松属素、高良姜素为0.20g/kg. 2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
3、凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6379 测试方法的精密度通过实验室间试验确定标准测试方法的重现性和再现性(GB/T6379-1986 ,neq ISO 5725:1981) GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682-1992，n叫lSO3696 :1 987) 3 原理甲醇溶解试样，反相液相色谱柱分离黄嗣化合物，八种黄隅化合物用液相色谱-串联质谱仪测定或用高效液相色i昔紫外检测器测定，外标法定量。4 试剂和材料除另有说明外，所用试jlJ均为优级纯，水为GB/T6682规定的一级水。4.1 甲醇=色谱纯。4.2磷酸。4.3 甲醇+水0+1):
4、量取50mL甲醇与50mL 7C混合。4.4 芦丁、杨梅嗣、棉皮素、鼓菲醇、芹菜素、松属素、背困和高良姜素标准物质纯度99%。4.5 芦丁、杨梅酣、懈皮素、蔬菲醇、芹菜素、松属素、苛因和高良姜素标准储备溶液z准确称取适量的每种标准物质(4.4)，用甲醇(4.1)配制成浓度为0.10mg/mL的混合标准储备溶液。4.6 芦丁、杨梅酣、懈皮素、王克菲醇、芹菜素、松属素、苟因和高良姜素标准工作溶液2根据需要用甲醇(4.1)和甲醇+水(4.3)将标准储备溶液(4.5)分别稀释成适当浓度的标准工作溶液。5 仪器5.1 液相色谱串联质谱仪:配有电喷雾离子源。5.2 高效液相色谱仪z配有紫外检测器。GB/T
5、 19427-2003 5.3 温度河源超声波水浴。5.4 注射过滤器=容积为3陌L或5mL，并带有在45m过滤5章。5.5 微量泼射器，25L，6 分析步骤在1t支撑滚滚购销备称取O.1 gO. 2 g试牛羊，精确IDJ0.001 g，置于50mL容量瓶内，加入40mL甲董事，在60C的超声泼水浴中，振荡40mn，待样品完全溶解后，取出冷却至蒙混。然后用甲醇定容至50mL100 mL.摇匀。用注射过滤器将试样溶液过滤至样品瓶内，摇匀后，供液相色谱仪测定。过滤的样液取1mL与1阳L水混合后，供液恕色滋伺串联质谱仪测定。6.2 草草定6.2.1 液榈色谱条件6.2. 1. 1 躏联质谱法a) .
6、滋校，MightysilRP-18 3m 150 mmX4. 6 mm(内径或榕王f;b) 流动裙，fl3醇十水(65十35)，黑磷梭(4.2)满节流动车在至pH=3;c) 流速，0.3mL!min , d) 进样量，20L。2.1.2 靠在外检部法a) t生i茜校，MghtysilRP-18 3m 15自mmX4.5mm (内经或领当者;川流动相z甲醇十*(58+42)，用磷酸(4.2)调节流动相至pH=3;c)流l!,0.7 mL/min; d) 检测波长，270nm; e) 茸样重，10L。6.2.2 )j重i曹条件a) 扫描方式.正离子扫描，b) 检测方式z多反应检测;c) 电喷雾电压
7、，4000V , dJ 享享化气压力2号.055MPa; e) 气帘气压力，0.069MPa事。辅助气流速，6L/min, g) 离子源温度，380C; h) 云簇电压，100V , i) J1生离子对、釜离子对和磁擦气章程主章，觅表1，表1八种资麟化合物的定性离子对、定麓离子对、碰撞气能量和去簇电f董名称碰撞气能簸!V45 45 40 45 45 35 45 45 GB/T 19427-2003 6.2.3 测定6.2.3.1 渡徊色调串联质谱检测法测定用芦丁、杨梅雨、懈皮素、孩菲醇、芹菜素、松属素、苛困、高良姜素标准储备溶液配成的混合标准工作溶液(4.6)分别进样，以标准工作溶液浓度为横坐
8、标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线.用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中芦丁、杨梅雨、懈皮素、茨菲醇、芹菜素、松属素、苛因、高良姜素的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下，芦丁、杨梅酣、懈皮素、茨菲醇、芹菜素、松属素、苛因、高良姜素的保留时间见表20芦丁、杨梅酣、懈皮素、鼓菲醇、芹菜素、松属素、苛因、高良姜素的总离子流图参见附录A中的图A.L褒2八种黄翻化合物的参考保留时阁黄嗣化合物名称保留时间/min芦丁6.41 杨梅酣7.66 懈皮章10.09 鼓菲醇14.18 芹菜章15.25 松属章24.56 苛因29.92 高良姜章36.19 6.2.3.2 液相色谱紫外检测法
9、测定根据试样溶液中每种黄酬化合物含量情况，选定峰高相近的标准工作溶液。标准工作溶液和试样溶液中每种黄酬化合物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。对标准工作溶液和试样溶液等体积参插进样测定。在上述色谱条件下，八种黄酣化合物出峰顺序和保留时间见表3。表3八种黄困化合物的参考保留时间黄酣化告物名称芦丁杨梅酣懈皮章鼓菲醇芹菜章松属素苛因高良姜素八种黄酣化合物标准物质的液相色谱图参见附录A中的图A.2o本方法的添加回收率数据参见附录B中的表B.L6.3 平行试验按上述步骤.对同一试样进行平行试验测定。6.4 空白试验除不称取试样外，均按上述分析步骤进行。保留时间/min3.326 4.224 6.367
10、 10.007 10.810 19.118 24.022 30.377 GB/T 19427-2003 7 结果计算7.1 液相色谱串联质谱检测法蜂胶中黄酣化合物含量利用数据处理系统计算或按式。)计算:V 1000 x= cX一X:-一一一一一一m 1000 X 1 000 ) 1 ( . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 式中zX 试样中黄嗣化合物含量，单位为克每千克(g!kg); c 从标准工作曲线得到的试样溶液中黄爵化合物的浓度，单位为微克每毫升(g/mL), V 试样溶液定容体积，单位为毫升(mL);m 最终试样溶液所代
11、表的试样质量，单位为克他。7.2 液相色谱紫外检测法蜂胶中黄商化合物含量利用数据处理系统计算或按式(2)计算2h X c, X V 1 000 x=一一-一-X一一-一一一一. ( 2 ) h , X m 1 000 X 1 000 式中=x-一一试样中黄阁化合物含量，单位为克每千克(g!kg); h一一试样溶液中黄阁化合物的峰高，单位为毫米(mm);h, 标准工作溶液中黄酣化合物的峰高，单位为毫米(mm);C-一标准工作溶液中黄阻化合物的浓度，单位为微克每毫升(g!mL); V一试样溶液最终定容体积，单位为毫升(mL);m 最终试样溶液所代表的试样质量，单位为克恼人注计算结果需将空白值扣除.
12、日精密度本标准精密度数据是按照GB/T6379的规定确定的，其重复性和再现性的值是以95%的可信度来计算。8.1 液帽色谱-串联质谱检测法8. 1. 1 重复性在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限(吵，蜂胶中芦丁、杨梅酣、懈皮素、羡菲蹲、芹菜素、松属素、苛因和高良姜素测定含量及重复性方程见表4.表4液相色谱串联质谱检测法八种黄嗣化合物含量范围及重复性和再现性方程黄翻化告物名称测定吉量/(g/kg)重复性限r再现性限R芦丁1.313-1. 401 Igr -7. 702 61g四十0.2175 R -0. 733 Im+ 1. 258 2 杨梅醺。.736-0.645I
13、gr -4. 480 4lgm- 1. 609 5 R -1. 009 3m-0. 849 5 懈皮章0.079-0.028 IgrO. 876 2Igm- 1. 2263 IgRO. 706 21gm一1.179 0 瑛菲醇0.421-0.171 Igr 1. 080 7lgm-口.7026 IgRO. 930 5Igm-0. 737 5 芹菜章0.403-0.132 IgrO. 691 6Igm- 1. 123 3 IgR口.7249Igm一0.9639 松属素2.056- 1. 075 Igr 1. 112 Olgm一0.9038 IgR 1. 066 2Igm-0. 726 3 苛因2
14、.954-1.236 IgrO. 820 Olgm-O. 8903 IgRO. 475 9Igm-0. 687 1 高良姜萦3.504-1. 163 IgrO. 474 7Igm-0. 800 4 IgRO. 989 5Igm-0. 676 1 注，m为两次测定结果的算术平均值.GB/T 19427-2003 如果两次测定值的差值超过重复性限(竹，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。8. 1. 2 再现性在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限(R)，蜂胶中芦丁、杨梅酣、懈皮素、茨菲醇、芹菜素、松属素、苛因和高良姜素测定含量及再现性方程见表4.8.2 液相色谱紫外
15、检测法8.2.1 重复性在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限(吵，蜂胶中芦丁、杨梅酣、榈皮素、孩菲醇、芹菜素、松属素、苛因和高良姜素含量范围及重复性方程见表5.襄5液相色谱-紫外检测法八种黄阁化合物含量范围及重复性和再现性方程黄困化合物名称吉量范围/(g/kg)重复性限r再现性限R芦丁。.20-100IgrO. 857 51gm- 1. 035 3 IgRO. 859 91gm-0. 989 3 杨梅嗣0.10-50 IgrO. 866 71gm- 1. 134 7 RO. 096 5m+0. 009 8 懈皮章0.20-100 IgrO. 884 91gm-0. 9
16、54 1 IgRO. 932 51gm一0.8442 瑛菲醇0.10-50 rO. 054 8m-0. 089 3 RO. 085 6m+0. 001 7 芹菜章0.10-50 rO. 033 9m+0. 0022 RO. 078 1m+0. 0034 松属素0.20-100 rO. 081 5m-0. 0046 IgRO. 966 41gm一1.003 9 苛因0.10-50 r=O. 035 4m十0.0019 RO. 067 5m十0.0042 高良姜素0.20-100 IgrO. 957 81gm一1.199 7 IgRO. 908 21gm一0.8888 注，m为两次测定结果的算术平
17、均值。如果两次测定值的差值超过重复性限(忡，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。8.2.2 再现性在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限(R)，蜂胶中芦丁、杨梅酶、棉皮素、政菲醇、芹菜素、松属素、苛因和高良姜素含量范围及再现性方程见表5.附录A(资料性附录)八种黄圈化合物标准物质的总离子流图和液相色谱圄GB/T 19427-2003 A.1 八种黄困化合物标准物质的总离子流图，见图A.I，1. 6e5 6.41 min芦T7.66 min腼梅困10.09mm榈皮章i4.18mm 董菲鄙15. 25mm芹辈章24. 56rnm 松属章29.92 ffim苛因36.
18、19 mo 高在薯1136.19 29.92 24.56 15.25 14.18 6.41 7.66 1. 4e5 8.0e4 1. 2e5 1. Oe5 6.0e4 4.0e4 2. Qe4 0.0. tlmin 1寸UM 图A.1A.2 八种黄酣化合物标准物质的液相色谱图，见图A.2。3.326 min芦丁4.224 min蝠梅商6.367 min 恻应量10.007mm 夜菲醇10.810 min 芹噩噩19. J18mm松噩噩24.022 min 苛困30, 377 nun 高良盖章hLF肉。NNO四YN岛一【由一。一同。同户。同kh甸的dvNN 凹的问0.09 0.05 0.04 O
19、. OB 0.07 0.06 0.03 0.02 Q.Ol Ilmin 20.00 30.00 图A.2f:,OfY:,.f:,-60f, 10.00 一Q.Ol0.00 0.00 附录B(资料性附录)回收.GB/T 19427-2003 本方法中液相色谱紫外检测法芦丁、杨梅嗣、懈皮素、鼓菲醇、芹菜素、松属素、苛因、高良姜素添加浓度及平均回收率的试验数据，见表B.1o亵B.1黄嗣化合物名称添加浓度/(g/kg)回收率/(%)0.2 91. 5 芦丁50 92.5 100 93.1 0.1 93.2 杨梅嗣25 92.1 50 91. 8 0.2 93.5 懈皮素50 93.3 100 92.4 。l93.4 亵菲醇25 94.2 50 92.3 0.1 93.0 芹菜素25 91. 7 50 92.6 0.2 92.7 松属素50 92.3 100 92.1 0.1 95.8 苛因25 91. 9 50 92.7 0.2 91. 3 高良姜素50 91. 6 100 92.0
