1、GB/T 19438.2-2004 前言GB/T 19438-2004 禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法分为以下四个部分2一-GB/T19438. 1 2004 (禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法); 一GB/T19438.2 2004 ( H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法们GB/T 19438.3 2004 ( H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法hGB/T 19438.4-2004 ( H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法儿本部分的附录A是资料性附录a本部分由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。本部分起草单位z中华人民共和国北京出入境检验检疫局、深圳市
2、匹基生物工程股份有限公司。本部分主要起草人，:XiJ环、张鹤晓、赖平安、周琦、刘宁。I G/T 19438.2-2004 H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法1 范围本部分规定了H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR操作方法。本部分适用于活禽及其产品中H5亚型禽流感病毒的检测。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB/T 19438.1-2004 禽流感病毒通
3、用荧光RT-PCR检测方法3 缩略语下列缩略语适用于本部分。3. 1 荧光RT-PCR荧光反转录聚合酶链反应。3.2 Ct值每个反应管内的荧光信号达到设定的阔值时所经历的循环数。3.3 RNA 核糖核酸。3.4 T呵酶Taq DNA聚合酶。3.5 PS 磷酸盐缓冲生理盐水。3. 6 DEPC 焦碳酸乙二醋。4 原理采用TaqMan方法，在比对禽流感病毒血凝素基因的基础上，设计一对仅在H5亚型禽流感病毒血凝素基因间保守的特异性引物和条特异性的荧光双标探针。该探针的结合部位位于目的扩增片段内部。其中5端标记FAM荧光素为报告荧光基因(用R表示)，3端标记TAMRA荧光素为洋灭荧光基团(用Q表示)，
4、它在近距离内能吸收5端荧光基团发出的荧光信号。反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测l不到荧光信号;而反应进行到延伸阶段时，T叫酶发挥5F3的外切核酸酶功能，将探针降解。这样探针上的GB/T 19438.2-2004 R基因游离出来，所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环往复.PCR产物呈指数形式增长，荧光信号也相应增长，实现f荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。5 试剂和材料5. 1 试剂除另有说明，所用试剂均为分析纯3所有试剂均用无RNA酶的容器(用DEPC水处理后高压灭菌)分装。5. 1.
5、 1 三氯甲炕。5. 1. 2 异丙醇20C预冷。5. 1. 3 75 %乙醇用新开启的元水乙醇和DEPC水配制.-20C预冷。5. 1. 4 0.01 mol/LCpH 7.2)的PBS配方见GB/T19438. 1-2004中附录A，121C土20C, 15 min高压灭菌冷却后，元商条件下加入青霉素、链霉素各10000 IU/mL, 5. 1. 5 H5 JF:型禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒l)试剂盒的组成、说明及使用注意事项参见附录A，5.2 仪器设备5. 2. 1 高速台式冷冻离心机2最大离心力12000 r/min以上。5.2.2 荧光PCR检测仪、计算机。5.2.3 2C
6、 -4C冰箱和-20C冰箱。5.2.4 微量加样器，0.5川，-10L.51，-20L.20L200L，200 I，L 1 000L。5.2.5 组织匀浆器。5. 2. 6 1.昆匀器。5.2.7 可移动紫外灯。6 样晶的采集与前处理采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。6. 1 取样工具下JIJ取样工具必须经121c士2C.15min高压灭菌或经160C士2C干烤2h, 拭子，剪、慑;研钵zEppendorf管(1.5时，)。6.2 采样方法6. 2. 1 活禽样晶取咽喉拭子和泄殖腔拭子，具体采集方法如下:咽喉拭子，采取时要将拭子深入喉头及上腾裂来回刮3次5次，取
7、咽喉分泌液;取泄殖腔拭子时，将拭子深入泄殖腔转一圈沾取粪便;将咽喉拭子和泄殖腔拭子一起放入盛有1.0 mL PBS的Eppendorf管中，编号备用。6.2.2 内脏或肌肉样晶用无菌慑剪夹取待检样品2.0g于研钵中充分研磨，再加10mL PBS 昆匀，或置于组织匀浆器中，加入10mL PBS匀浆，然后将组织悬液转入元菌Eppendorf管中3000/min离心10min取上清液转2 1 )由指定单位提供，给出这一信息是为了万便本标准的使用者，并平表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。人Eppendorf管中，编号备用。6.2.3 血清或血浆用无菌注射器直接吸
8、取至无菌Eppendorf管中，编号备用。6. 3 存放与运送GB/T 19438.2-2004 采集或处理的样本在2C8C条件下保存应不超过24h;若需长期保存，须放置70C冰箱，但应避免反复冻融(最多冻融三次)。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。7 操作方法7. 1 实验室的设置与管理实验室的设置与管理见GB/T19438. 1-2004中附录C。7.2 样本的处理在样本处理区进行。7. 2. 1 取n个1.5 mL灭菌Eppendorf管，其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和，对每个管进行编号。7.2.2 每管加入600L裂解液，然后分别加入待
9、测样本、阴性对照、阳性对照各200L，吸头反复吸打混匀(一份样本换用一个吸头h再加人200L三氯甲烧，混匀器土震荡混匀5s(不宜过于强烈，以免产生乳化层，也可用手颠倒混匀)。于4(条件下，12000 r/min离心15min. 7.2.3 取与7.2. 1中相同数量的1.5 mL灭菌Eppendorf管，加入400L异丙醇(-20C预冷)，对每个管进行编号。吸取7.2.2离心后各管中的上清液转移至相应的管中，上清液至少吸取500L，注意不要吸出中间层，颠倒混匀。7.2.4 12000 r/min离心15min(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)。轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，
10、沾干液体，不同样品应在吸水纸不同地方沾干。加入600L75%乙醇，颠倒洗涤。7.2.5 于4C条件下，12000 r/min离心10min (Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)。轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上dl占干液体，不同样品应在吸水纸不同地方沾干。7.2.6 4000 r/min离心10s(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥3 min。不宜过于干燥，以免RNA不榕。7.2.7 加入11LDEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA,2 000 r/m
11、in离心5s，冰上保存备用。提取的RNA须在2h内进行RT-PCR扩增或放置于70(冰箱。7.3 扩增试剂准备与自己置在反应混合物配制区进行。从试剂盒中取出AIVH5亚型RT-PCR反应液、T叫酶，在室温下融化后，2000 r/min离心5s. 设所需PCR数为n，其中n为待检样品数、管阳性对照及一管阴性对照之和，每个样本测试反应体系配制见表L表1测试反应体系配制表试剂RT-PCR反应液/LTaq酶/L用量15 0.25 计算好各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，向其中加入0.25X n颗RT-PCR酶颗粒，充分混合均匀，向每个PCR管中各分装15L，转移至样本处理区。7.4 加样在样本处理
12、区进行。在各设定的PCR管中分别加入7.2.7中制备的RNA溶液各10L，盖紧管GB/T 19438.2-2004 盖后，500r/min离心305, 7.5 荧光RT-PCR反应在检测区进行。将7.4中加样后的PCR管放人荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。循环条件设置:荧光RT-PCR检测H5亚型禽流感病毒的反应参数为第一阶段，反转录42C/.，Omin; 第二阶段，预变性9rC/3min; 第=三阶段.92C/IOs.45C/30 5.72C /l min.5个循环;第四阶段，但C/IOs.60C /30 5.40个循环，荧光收集设置在第四阶段每次循环的退火延伸时进行。8 结果判定8.
13、 1 结果分析条件设定i主取检测结果。阔值设定原则以阂值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，结果显示阴性为准。或可根据仪器噪音情况进行调整。8.2 质控标准8. 2. 1 阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。8.2.2 阳性对照的Ct值应小于28.0.并出现典型的扩增曲线。否则，此次实验视为无效。8.3 结果描述及判定8. 3. 1 阴性无Cti并且无扩增曲线，表示样品中无H5亚型禽流感病毒。8.3.2 阳性Ct值小于等于30.0.且出现典型的扩增曲线，表示样本中存在H5亚型禽流感病毒。8. 3. 3 有效原则Ct值大于30.0的样本须重做。重做结果无Ct值者为阴性，否则为阳性。4 GB/T
14、 19438.2-2004 附录A(资料性附录)H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR试剂盒组成、说明及使用时的注意事项A. 1 试剂盒的组成组成成分(48反应/盒)体积样丰处理试剂裂解液30 mLX 1盒核酸扩增试剂H5亚型禽流感病毒RT-PCR反应液750LX1管RT-PCR酶1颗/管X12管Taq酶(5U/L) 12LX1管DEPC水1 mLXl管对照品阴性对照1 mLX1管阳性对照(非感染体外转景RNA)1 mLX1管A.2 :且明A. 2. 1 裂解液的主要成分为异硫氨酸肌和盼，为RNA提取试剂，外观为红色液体，于4C保存。A. 2. 2 OEPC水，是用l%OEPC处理后的去离子水，用于溶解RNA.A. 2. 3 RT-PCR反应液中含有特异性引物、探针及各种离子。A.3 使用时的注意事项A. 3. 1 由于阳性样品中模板浓度相对较高，检测过程中不得交叉污染。A. 3. 2 反应液分装时应尽量避免产生气泡，上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。A. 3.3 RT-PCR酶颗粒极易吸潮失活.RT-PCR酶在室温条件下必须置于干燥器内保存，使用时取出所需数量，剩余部分立即放回干燥器中。A.3.4 除裂解液外，其他试剂20C保存。有效期为6个月。5
