1、GB/T 19438.4-2004 前言GBjT 19438-2004 (禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法分为以下四个部分gGBjT 19438.1-2004 (禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法h一GBjT19438.2-2004 (H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法hGBjT 19438.3-2004 ( H7亚型禽流感病毒荧光RT一PCR检测方法以GBjT 19438.4-2004 (H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法儿本部分的附录A是资料性附录。本部分由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。本部分起草单位:中华人民共和国北京出入境检验检疫局、深圳市匹基生物工
2、程股份有限公司。本部分主要起草人:张利峰、张鹤晓、刘继红、郭晋优、刘艳华、杨伟。I GB/T 19438.4-2004 H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法1 范围本部分规定了荧光RT-PCR检测H9亚型禽流感病毒的操作方法。本部分适用于活禽及其产品中H9亚型禽流感病毒的检测。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB/T 19438.1 2004 禽流感病
3、毒通用荧光RT-PCR检测方法3 缩赂语下列缩略语适用于本部分。3. 1 荧光RT-PCR荧光反转录聚合酶链反应。3. 2 Ct值每个反应管内的荧光信号达到设定的阑值时所经历的循环数。3. 3 RNA 核糖核酸。3.4 DEPC 焦碳酸乙二醋。3.5 PBS 磷酸盐缓冲盐水。3.6 Tq酶Taq DNA聚合酶。4 原理H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法是采用TaqMan技术。设计一对仅在H9亚型禽流感病毒血凝素基因间保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。探针的5端和3端分别标记不同的荧光素，如5端标记FAM荧光素，它发出的荧光能够被检测仪器接收，称为报告荧光基团(用R表示) 3
4、端一般标记TAMRA荧光素，它在近距离内能吸收5端报告荧光基因发出的荧光信号，称为洋灭荧光基团(用Q表示)。当PCR反应在退火阶段时，一对引物和一条探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发GB/T 19438.4-2004 出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到R所发出的荧光信号;当PCR反应进行到延伸阶段时，T叫酶在引物的引导下，以四种核昔酸为底物，根据碱基配对的原则，沿着模板链合成新链;当链的延伸进行J探针结合部位时，受到探针的阻碍而无法继续，此时的Taq酶发挥它的f3外切核酸酶的功能，将探针切成单核音酸，消除阻碍，与此同时标记在探针上的R基因游离出来，R所发出的荧光再不为Q所吸收
5、而被检测仪所接收g在T叫酶的作用下继续延伸过程合成完整的新链，R和Q基团均游离于溶液中，仪器可继续检测到R所发出的荧光信号。5 材料与试剂5. 1 试剂除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNA酶污染的容器用DEPC水处理后高压灭菌)分装。5. 1. 1 三氯甲:烧。5. 1. 2 异丙醇(-20C预冷)。5. 1. 3 PBS:配方见GB/T19438. 1-2004中附录A.121C士2C, 15 min高压灭菌冷却后，元菌条件下加入青霉素、链霉素各10000 IU/mL. 5. 1. 4 75 %乙醇2用新开启的无水乙醇和无RNA酶的水配制，-20C预冷。5. 1.
6、5 日9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒.组成、说明及使用注意事项参见附录A.5.2 仪器与器材5. 2. 1 荧光RT-PCR检测仪。5.2.2 高速台式冷冻离心机(最高转速12000 r/min以上)。5.2.3 台式离心机(最高转速2000r/min)。5.2.4 混匀器。5.2.5 冰箱(2C8C和20C两种)。5.2.6 可移动紫外灯。5.2.7 微量可谓移液器及配套带滤芯吸头(10L、100L、1000L)。5.2.8 专用毛细玻璃管或PCR管。5.2. 9 Eppendorf管(1.5mL)。6 抽样6. 1 采样工具下列采样工具必须经121C土2C，15min高压灭菌并
7、烘干2一二棉拭子;一二剪刀、银子，一二注射器，一二1.5 mL Eppendorf管;一二研钵。6.2 样晶采集6. 2. 1 活禽2 取咽喉拭子和泄殖腔拭子，采集方法如下2一二取咽喉拭子时将拭子深入喉头口及上顿裂来回刮3次5次取咽喉分泌液z1 )由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。GB/T 19438.4-2004 取泄殖腔拭子时将拭子深入泄殖腔转一圈并沾取少量粪便，将同一样品的咽喉拭子和泄殖腔拭子一并放入盛有1.0 mL PBS的1.5 mL Eppendorf管中，加盖、编号。6.2.2 肌肉
8、或组织脏器待检样品装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号，送实验室。6.2.3 血清、血浆用无菌注射器直接吸取至无菌Eppendorf管中，编号备用。6.3 样晶储运样品采集后，将采集的样品放入密闭的塑料袋内(一个采样点的样品，放一个塑料袋).于保温箱中加冰、密封，送实验室。6.4 样晶制备6. 4. 1 咽喉、泄殖腔梳子样品在混匀器上充分混合后，用高压灭菌慑子将拭子中的液体挤出，室温放置30min，取上清液转入无菌的1.5 mL Eppendorf管中，编号备用。6.4.2 肌肉或组织脏器取待检样品2.0g于己洗净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加10mL PBS混匀，4C、30r/min 离心
9、15min，取上清液转入无菌的1.5 mL Eppendorf管中，编号备用。6.5 样本存放样本在2C8C条件下保存应不超过24h，若需长期保存应放在一70C以下冰箱，但应避免反复冻融(冻融不超过3次)。7 操作方法7. 1 实验室的设置与管理实验室的设置与管理见GB/T19438. 1-2004中附录C.7.2 样本的处理在样本制备区进行。7. 2. 1 取n个灭菌的1.5 mL Eppendorf管，其中为被检样品、阳性样品与阴性样品的和(阳性样品、阴性样品在试JilJ盒中己标出)，做标t 7. 2. 2 每管加入600L裂解液，分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各200L，一份样本换
10、用一个吸头，再加入200L三氯甲烧，混匀器上振荡混匀5s(不能过于强烈，以免产生乳化层，也可以用手颠倒混匀)。于4C、12000r/min离心15min. 7.2.3 取与7.2.1相同数量灭菌的1.5 mL Eppendorf管，加人500L异丙醇(-20C预冷)，做标记。吸取7.2. 2各管中的上清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取500L，不能吸出中间层，颠倒混匀。7.2.4 于4C、12000 r/min离心15min (Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)，小心倒去上清液，但l置于吸水纸上，沾干液体(不同样品须在吸水纸不同地方沾干);加入600L75%乙醇，颠倒洗涤。
11、7.2.5 于4C、12000 r/min离心10min(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)，小心倒去上清液，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体(不同样品须在吸水纸不同地方沾干)。7.2.6 4000r/min离心10s(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)，将管壁上的残余液体甩到管底部，小心倒去上清液，用微量加样器将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥3mn，不能过于干燥，以免RNA不溶。7.2.7 加入11LDEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2000 r/min离心55，冰上保存备用。提GB/T 19438.4-2004 取的RNA
12、须在2h内进行PCR扩增，若需长期保存须放置于70C冰箱。7.3 检测7. 3. 1 扩增试剂准备在反应混合物配制区进行。从试剂盒中取出相应的荧光RT-PCR反应液、T叫酶，在室温下融化后，2000 r/min离心55，设所需荧光RT-PCR检测总数为n，其中n为被检样品、阳性样品与阴性样品的和，每个样品测试反应体系配制见表L表1每个样晶测试反应体系配制表试剂RT-PCR反应液/LTaq酶/L用量15 口.25 根据测试样品的数量计算好各试剂的使用量，加入到适当体积试管中，按每四份样品加入一颗RT-PCR反转录酶颗粒，计算应加入的酶颗粒数，充分混合均匀，向每个荧光RT-PCR管中各分装15L反
13、应混合物液体，转移至样本处理区。7.3.2 加样在样本处理区进行。在各设定的荧光RT-PCR管中分别加入7.2.7中制备的RNA溶液各10L，盖紧管盖，500r/min 离心305 , 7.3.3 荧光RT-PCR检测在检测区进行。将7.3.2中离心后的PCR管放入荧光RT-PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。循环条件设置:第一阶段，反转录42C/30min; 第二阶段，预变性92C/3min; 第三阶段，但C/10s , 45 C /305 , 72C /lmin , 5个循环g第四阶段，92C/lOs , 60C /30s , 40个循环，在第四阶段每次循环的退火延伸时收集荧光。试验检测结束
14、后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。8 结果判定8. 1 结果分析条件设定直接读取检测结果。阔值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阔值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。8.2 质控标准8. 2. 1 阴性样品元Ct值或元扩增曲线。8.2.2 阳性对照的Ct值应小于28.0，并出现典型的扩增曲线。否则，此次实验视为元效。8.3 结果描述及判定8. 3. 1 阴性无Ct值或无扩增曲线，表示样品中无H9亚型禽流感病毒。8.3.2 阳性Ct值小于等于30.0，且出现典型的扩增曲线，示样品中存在H9亚型禽流感病毒。8.3.3 有效原则Ct大于30.0的样本建议重做。重做结果无数值者为阴性
15、，否则为阳性。4 GB(T 19438.4-2004 附录A(资料性附录)H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒的组成A. 1 试J盒组成每个试剂盒可做48个检测，包括以下成分z裂解液DEPC水H9亚型禽流感病毒RT-PCR反应液RT-PCR酶T叫酶阴性对照阳性对照(非感染性体外转录RIA)A.2 说明30 mLX 1盒1 mLX1管750LX1管1颗/管X12管12LX1管1 mLX1管1 mLX 1管A. 2. 1 裂解液的主要成分为异硫氨酸肌和盼，为RNA提取试剂，外观为红色液体，于4c保存。A. 2. 2 DEPC水，是用l%DEPC处理后的去离子水，用于溶解RNA，A. 2. 3 日9亚型禽流感病毒RT-PCR反应液中含有检测H9亚型禽流感病毒的特异性寻l物、探针及各种离子。A.3 使用时的注意事项A. 3. 1 由于阳性样品中模板浓度相对较高，检测过程中不得交叉污染。A. 3. 2 反应液分装时应避免产生气泡，上机前检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。A. 3. 3 RT-PCR酶颗粒极易吸潮失活，必须在室温条件下置于干燥器内保存，使用时取出所需数量，剩余部分立即放回干燥器中。5
