1、GB/T 19439-2004 前言高致病性禽流感由正粘病毒科流感病毒属中A型i流感病毒引起，世界动物卫生组织COJE)列为A类疾病，我国将其列为一类动物疫病。依赖核酸序列的扩增技术CNASBA)检测禽流感病毒的敏感性与经典的鸡胚病原分离方法相当，并具有检测速度快、特异性强、与鸡胚病原分离方法符合率高、易于操作的特点。本标准是在综合我国科研成果的基础上，参考。IE(诊断试验和疫苗标准手册)(2000年版)，并结合我国现有动物卫生法规及农业部对禽流感的相关政策和措施制定的。本标准附录A、附录B、附录C为规范性附录，附录D为资料性附录。本标准由上海市质量技术监督局和中华人民共和国上海出入境检验检疫
2、局提出。本标准由国家质量监督检验检疫总局归口。本标准起草单位2中华人民共和国上海出入境检验检疫局、上海市质量技术监督局、香港基因晶片开发有限公司。本标准起草人:单松华、陈家华、谢燕、杨锡全、倪旦红、刘乐庭、刘俊平。I GB/T 19439-2004 H5亚型禽流感病毒NASBA检测方法1 范围本标准规定了NASBA快速检测H5亚型禽流感病毒技术规范的材料准备、操作方法和结果判定。本标准适用于禽类、禽肉产品中H5亚型禽流感病毒的快速检测、诊断。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准
3、，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是沓可使用这些文件的最新版本。凡是不注目期的引用文件，其最新版本适用于本标准。G B/T 18936 , , 2003 高致病性禽流感诊断技术3 原理N ASBA (N ucleic acid seq uence- based am叫plif们lcat续、等温、基于酶反应的核酸扩增技术。该技术使用三种酶(反转录酶、核糖核酸酶H、噬菌体T7核糖核酸聚合酶)和两条寡核背酸引物。上游引物5F末端含有噬囱体T7的依赖于D:-.JA的RIA聚合酶的启动子序列，下游引物的5末端含有和钉标电化学发光检测探针互补的序列口在扩增步骤中，两个5 端都整合进扩增序列中，这样既
4、成为产生互补RNA序列的模板，又能特异性结合检测步骤中的ECL探针。扩增底物与ECL探针形成复合物，携带该复合物的磁珠被电极的表面磁性捕获。电极上的电压引起电化学发光(ECLl反应。己杂交上的钉标磁珠发出的光和扩增反应产生的RNA扩增产物总量成比例对应。4 材料准备4. 1 试验环境干净的环境，最好分区。分为核酸提取、核酸扩增和核酸检测三个区。4.2 器材采用常规的分子生物学器材，包括:一次性手套、移液器(量程5f1L到200L)、枪头、无RNA酶的1. 5 mL塑料离心管、1.5 mL离心管架、5mL试管架、旋涡振荡器、计时器、高速台式离心机、温度计(精度士2C)、加热器、水浴锅、5mL聚丙
5、烯试管(VWR)、封口膜等。如果采用ECL方法，需要NucliSens阅读器或者等同的仪器。如果采用ELISA方法，需要酶标仪。4. 3号!物上游引物AATTCT AAT ACG ACT CAC TAT AGGGAG AAG G CCA IAA AGA (C/TlAG ACC AGC TA 下游引物GATGCA AGG TCG CAT ATG AGG AGA GAA GAA GAA AAA AGA GAG GAC 4.4 检测试剂所有检测试剂在使用前，使其达到室温。a) 裂解缓冲液:5 mol/L异硫氨酸肌，10%Trito口X-100，10mmol/LTris-HCl, pH 8.3; bl
6、 冲洗缓冲液5mol/L异硫氨酸肌，10mmol/LTris-HCl，pH8.3; c) 500 mg/mL硅土:500 mg/mL盐酸活化的二氧化硅;1 GB/T 19439-2004 d) 洗脱缓冲液10mmol/L Tris-HCl , pH 8.3 , e) 酶溶液(参见附录A), f) H5捕捉探针，10mmol/L生物素化寡聚核背酸;探针序列为Biotin-GCCA/G)AGT TCCC/ T) CTA GCA CTG GCA AT g) 电化学发光1.1;属别检测探针(10mMgeneric ECL detection probe) :钉标记的DNA寡聚核背酸;ECL序列为GAT
7、GCA AGG TCG CAT ATG AG GT GACC/T) AAT GAA TGCC/T) ATG GAA h) 仪器调试参照液，10 mmol/L NASBA CP , 1 mmol/L Tris-HCl pH8. 3, 3 mmol/L NASBA ECL, i) 检测稀释液，15mmol/LTris-HCl, pH 8.3 , j) 分析缓冲液，50mmol/LTris-HCl, pH 8. 3, 1XPBSCl 37 mmol/L NaCl , 2.7 mmol/L KCl , 10 mmol/L Na, HPO, , 2 mmol/L KH2PO,), k) 清洗液，100r
8、nmol/L KOH , 10%SDS, 10% Triton X-l00 , l) 元水乙醇。4.5 样晶采集、保存、处理按GB/T18936-2003中2.1进行。5 操作方法5. 1 核酸释放和提取按以下顺序za) 将0.1mL样品加入盛有0.9mL裂解缓冲液的管中并振荡混合;b) 振荡混合硅土悬浮液并向每个管中加入50L;c) 振荡混合均匀;d) 室温下温育10minC每2min振荡混合次，防止硅土沉淀he) 在12000 r/min下离心裂解缓冲液管30问f) 小心移除上清液(不要搅动沉淀)后，向每个管中加入1mL冲洗缓冲液;g) 振荡混合直至管中沉淀重新完全悬浮为止;h) 在120
9、00r/min下离心30S.然后移除上清液;i ) 重复第f)步到第h)步的步骤。依次为一次使用冲洗缓冲液;两次使用70%乙醇;最后次使用100%乙醇;j ) 最后一次洗涤步骤后，用移液器小心移除残余乙醇;k) 使用加热器在56C敞口干燥硅土10minC用薄纸覆盖每个管避免污染h1) 干燥后向每个管加入50L洗脱缓冲液;rn) 振荡试管直至沉淀物再次重新完全悬浮，n) 56C温育硅土悬浮液10min以洗脱核酸(5min后开始振荡试管), 0) 在12000r/min下离心2min; p) 将5I，L核酸上清液转移至新试管，在1h内开始扩增反应。以上步骤也可采用Qiagen或者等同的其他试剂盒进
10、行。5.2 核酸扩增按以下顺序za) 向上述5L核酸5.1p)中加入10L扩增试剂(参见附录A), b) 65。温育5rnin; 2 c) 41.C温育5min; d) 加入5L酶溶液参见附录B)，并用子指轻轻扣击试管促使混合均匀ge) 放回试管，并继续在41.C温育5min; f) 将试管稍作离心后，在41.C温育90min; u 检测扩增产物sh) 在70.C下保存扩增产物不超过30d. 5.3 核酸检测按照以下步骤或用ELlSA进行检测.a) 将(N!)+2)个5mL聚丙烯试管进行编号。试管l作为空白对照，b) 振荡混合，除了试管l外，其余试管各加入20L杂交溶液(参见附录。，c) 试管
11、2中加人5L检测稀释液作为空白对照;d) 其余试管各加5LRNA扩增产物se) 封口膜封住所有试管，振荡混合;。所有试管41.C温育30min。每10mn混合一次gg) 除了试管1外，其余试管各加入0.3mL分析缓冲液;h) 振荡仪器调试参照液直至不透明，然后加0.25mL IRS到试管1; o 把试管放在转盘式传送盘的适当位置上;j) 运行NucliSens阅读器，对数据进行分析和解释L参见附录DJ。6 结果判定GB/T 19439-2004 通过大量分析已知阴性对照样品后，确定NASBA/ECL的临界值为O.15 X仪器参照榕液的数值。样品的读数超过临界值时，判为H5亚型禽流感病毒阳性，低
12、于临界值时，判为H5亚型禽流感病毒阴性。1) N为样品数。3 GB/T 19439-2004 附录A(规范性附录)扩增试剂的配制A. 1 配制材料a) 球状骨针:单个球状骨针为10mg , 4 mmol/L :lTP , 15 mmol/L OTT, 40 mmol/L MgCl川b) 球状骨针稀释剂:100 mmol/L Tris-HCl pH8. 3 , 2 mmol/L dNTP, c) 100 mmol/L氯化何溶液，d) 10 mmol/L H5引物混合物ge) DEPC水。A.2 配制过程a) 单个球状骨针中加入80L球状骨针稀释剂，并迅速振荡均匀;b) 稀释的球状骨针中加入16L
13、氯化树溶液和14LOEPC水，振荡均匀;c) 加入10LH5引物混合物，振荡混合;d) 不能离心;e) 在30min内使用。附录B(规范性附录)酶溶液的配制B. 1 配制材料a) 酶球:单个酶球(6.5mg)含1.3 U/L AMV-RT , O. 5 U/L RNase H ,l. 3U/L T7 RNA聚合酶，100mmol/L Tris-HCl, pH 8.3 , 10%BSA, b) 酶球稀释齐1:0.42g/LBSA。B.2 酶溶液的制备a) 单个酶球中加入55L酶稀释液，将此溶液放置室温至少20min; b) 用手指轻轻扣击试管让酶球充分溶解;c) 不能剧烈振荡任何含酶的溶液;d)
14、 使用前，稍作离心;e) 在60mn内使用。附录C(规范性附录)杂交溶液的配制C. l 配制材料a) H5捕捉探针:10mmol/L生物素化寡聚核昔酸;4 GB/T 19439-2004 b) 电化学发光法属别检测探针(10mMgeneric ECL detection probe)钉标记的DNA寡聚核音酸。C. 2 杂交溶液制备a) 振荡H5捕捉探针和ECL探针直到形成不透明溶液。b) 对于N次特异性检测反应，在新试管中混合(N+2)XIOLH5捕捉探针和(N+2)Xl0LECL探针。c) 使用前稍作振荡。d) 在60min内使用。附录D(资料性附录)NucliSens阅读器的操作运行D.
15、1 建立一个新的运行程序。D. 1. 1 打开NucliSens阅读器的个人电脑。D. 1. 2 在开始界面点击Prirne来执行系统校准。以1.3机器准备好后，点击Start。校准步骤大约持续3mino D. 1. 4 在登入Clog-in)界面的用户名(username)上选择Serviceengineer并且点击Login。不需要输入密码。D. 1. 5 在屏幕左上方选择Routine菜单然后点击Newrun。D. 1. 6 在弹出的工作表界面点击yes。D. 1. 7 输入文件名(不超过8个字符)并且点击ok。D且.1.8一个工作表单会打开在分析选择栏(selectedassay)选择
16、Fre白etube D. 1. 9 输入样品号并且点击Addto li川飞。D. 1. 10 重复上述步骤直到输入所有样品100D. 1. 11 输入所有样品号后，点击Close键。D. 1. 12 屏幕出现了一张列有所有样品号的工作表。检查工作表，检查元误后点击okoD.2 确定样品放在转盘式传送盘(instrumentcarousel)上，并且按照计算机中输入的样品10顺序摆放。D.3 在屏幕上方选择Routine菜单，然后点击Runworklist。D.4 出现一个检查弹出窗口，点击Proceed。D.5 检测开始(每个试管用时大约1.5min)。D.6 检测停止后，在屏幕左上方选择Routine菜单，然后点击Sampleresults或者Assayresult显示结果。b
