1、lCS 67.050 B 04 和国国家标准主主J，、中华人民GB/T 19495. 8-2004 转基因产品检测蛋白质检测方法Detection of genetically modified plants and derived products一Protein based methods 2004-04-13发布主卡华人民共和国国家蔬量监督检验捡痊总局中国国家标准住管理委员会2004-04-13实施发布GB19495.8-200乓目次前言1 范围.z. .,.- 1 2 规范性引用文件3 术语和定义4原理.00000 H _. 2 5 试剂., . 2 6 仪器设备.司，.2 7 滚样，
2、.，. . . . . . . . . . . 2 8 程序，.e，.3 9 结果的分析与表述.u. 3 10影响检测结果的参数.u. 4 11 验证方法.-. 4 12 捡泌报告，.,. 4 附录AC统范性然录转基到植物及其产品中C到EPSPS蛋出的ELISA检泌，. 5 附录拟姨范性附录转基因植物及其产品中心ylAb/Ac蛋白的试纸条检测.10 参考文献. ，哩。.，.14 前言GB.IT 19495（转基因产品检测为系列标准GBiT l 9495. l 20民转基因产品检撼通用要求积定义；c;H/T 19495. 2 2004转基因产品检然实捡室技术要求号GRIT 19495. 3 20
3、04 转基因产品检lii!I核酸提取络化方法：GB/T l 9495. 4 2004 转基因产品检法i核段定性PCR检泌方法$GB/T 19495. 5 2004转基因产品检测核酸定量PCR检派方法；GB,iT 19495. 6 2004转基层产品检测基因芯片检测方法gGB/T 19495. 7 2004转基因产品检测抽样和制样方法乎GH/T l4号5.8 2004 转基因产品检i!l!蛋白凌检湾方法。本部分何录A、附录8为主军范性附录。本部分泪国家认证认可监督管理委员会提出并归口。不部分泊中华人民共和国质量监督检验检疫总局批准发布。GB/T 19495. 8-2004 本部分起草单位g上海市
4、农业科学院、中国农业大学、中国农业科学院生物技术研究所、农业部科技发展中心、国家质量监督检验检疫总局动植物检疫实验所、上海交通大学、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、华南农业大学3卒部分主要莲草人：张大兵、黄昆仑、陆伟、法爱虎、付中文、朱水芳、梁婉琪、贾军伟、潘良文、梅曼彤。本部分系首次发布的国家标准。GB/T 19495. 8-2004 转基冒产品拴测蛋白匮检测方法1 范围GBiT 19495的本部分适用于以检测巨标蛋白为基础的转基因产品定性定量检吉普方法。本部分附录中列出的检雪警方法是以现有抗体为基础的检泌方法。2 虫草范性引用文件下列文件中的条款通过GB19495的本部分的引用而成为本
5、部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注目贱的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB19495. 1 2004转基因产品检测适用要求和定义GB/T 19495. 2 2004转基困产品检测实验室技术要求GB/T 19495. 72004转基困产品检测摇样和能祥方法3 术活和定义下歹rj术语和定义适用于GB/T194部的本部分。3. 1 一段术语3. 1. 1 基质mart ix 测试样品中包含被溶解或固定豹吕标蛋白的所有物质组分的混合物c3. 1. 2 蛋白质变性
6、d回国盯ationof proteins 由于物理或化学等处理使目标蛋白的结构受到破坏或修饰，其功能、酶学性质或抗原位发生玫变。3.2 与抗体有关的术语3. 2. 1 抗体antibody B淋巴细胞对异窃、成分分子（抗原反应时产生并分泌的免疫球蛋白，可与抗原特异性结合3.2.2 抗原antigen 被免疫系统识到、并可激发免疫系统产生免疫反应的物质c3.2.3 克隆clone来源于一个单缀抱系的格同级抱e3. 2. 4 交叉反应Cl咽s-reactivity主立体与目标蛋白之外的其他物质结合的现象。3.2.5 单克隆抗体monoclonal anti如叫y针对一个抗原决定簇飞从一个杂交瘤细胞
7、克隆产生的抗体。GB/T 19495. 8-2004 3.2.6 多克隆抗体polycl佣alantibody 针对多个抗原决定簇，由多个淋巴结跑克隆产生的抗体。3.2. 7 抗体特异性Sp配ificityof an antibody 一种抗体可专一地与一个抗原决定簇结合而不与其他抗原决定簇结合的主主力。3. 3 吕标蛋白为基磁的检测技术有关术语3. 3. 1 fill草案抗体co町ugate扭tibody 与一个重草或荧光物质结合的抗体。3. 3.2 蛋白质免瘦印迹westernlotting从聚丙烯酸毅凝舷上将经过电泳分离的蛋白羡转移到困裙子质七，目标蛋白可被标记抗体特异识别的方法。3.3
8、.3 酶联免疫吸黝分析ELISA enzyme linked immunosor忧nta皿ay利用酶联抗体和？或物形成有颜色反应的产物的手中体外运量分桥方法。3. 3. 4 检测试剂盒test kit 用于检测某一特定成分的一组法剂的结合体。3.3.5 检测试纸条dip stick format 抗体或分析物包被在边格支持物表葱，运合快速定性分折的侧向流动试纸条。4 原理从测试辛辛品中按照一定的程序拙提出含有目标蛋白的基层，利泪抗体与白标蛋白抗原）特异性结合辛辛性，通过j禹联抗体与找原抗体复合物的作用产生nJ检泌的信号。5试探除另有规定外，所有试剂的等级和要求应符合本部分部附录A、附录丑辛DG
9、B/T 1吉493.220低中的规定。如未明确规定的，试岗应是分子生物级的在所旬io立刻j的储存和使用应符合供应I育和实验室必要求。6 仪器设备6. 1 搅拌器。6.2 匀浆器。6.3 冷冻萄心在1(4000 g 0 ooc g). 6.4 酶标议。7 取祥? 按.!flGB/T 19195. 7 20凶中约规定执行。会指定单位提供结出这一信息是为了方便本部7前使涓者，并f在表FE才该产品的认可。直E果其f远等教产品美在相同刽效果，员i可使患这些等效产品。GB/T 19495. 8-2004 8 程序8. 1 一假要求抗体、f肉联抗体、底物等的贮藏条件平n保质期Ilif.与生产商要求致e为了实
10、施本部分，应注意实验室的患意保证（如有关仪器的校液、两次测定、空白、标准物质的使用、制作标准曲线等），认真清洗与样品直接接触的所有仪器，以防污染。8. 2 样品滚液的准备称取运最有代表性的分析样品于聚丙烯管中，其中部分用于蛋白质拍摄，加入揣提液，匀浆或混匀，ffj!J备样品溶液。对于团体等不能直接测试的样品，经磨郎、搅拌等处理后进行测试。粉末、副粉有膨张特性号有时需要用两倍体积的撼提液。2旨坊含最离的实验室样品苦需要给提较大部澳i试样本。8.3 蛋白质拍摄选用适于特定基质的抽提方法。测试样品或标准品的损提和稀辛辛等在附录里面有详细描述。应使用聚丙烯管始提蛋白以避免蛋臼吸F宫。在拍提幸n分析吉利
11、使用相同的缓冲液以尽可能减少基质对检测的影响，抽提缓冲液应保证最大最地从样品中抽提出目标ii白成分。8. 4 标准曲线的制作使用与基质一致的阳性标准品制作标准曲线。8.5 分析程序按照本部分附录所JI程序根据空白对照、黯然标准Iii,、病住标准品及测试祥品的数量选载适量的检测试剂，将测试测样品的溶液稀释到适合分析的浓度。根据所选方法，轻较混匀，使反应在规定的时间和温度范围内进行，根据附录所述方法终止反应，及时i卖出检测数值。9 续果的分析与表述9. 1 一般要求重复测定同样品的吸光僚的差异不得超过15%，计算所得的浓度差异不得超过20%。如果超过变异系数百分数的主椒，必须重新选取样品检需：！重
12、复3次以上。检测结果不能表述为在祥品中无转基闵成分。9.2 定量分在野有害要分析下列参数2空白对照、阳性标准品、阴性标准品及11!tli式样品的原始数据1重复试禄的变异系数省分值；阳性标准品的变异系数百分f在：一对照样品的变异系数百分值。所有最后检测结果在报告对者在必须考虑检测方法均不确定度。定量结果成根据在阳性标准品线性泡围内的测量值来计算。9. 3 结果的表述定性检测结果表述：阴性结果：“在检测下限J；长检测到xx”或“低于xxx检测的下限时米检测到xx限性结果z“XX检损j下llll!M检吉普到”或“高于检泌的下段时检测到”。定量枪测结果麦述：一低于定量下限的阳性综呆z“！吧馁，高于检测
13、下限，很低于定建下限”。高于Ii二量p在ll1性结果：“在检测下限时检测到IJXX，含量为xxx”或“高于检测下限时检测到，含量为xxx”。3 GB月19495.8-200410 影响捡测结果的参数每次测试样品得到的实验数据，应与试剂盒的各种参数的标准筐进行比较，以保证检测结果揭可靠性和一致性，当检测的数值与试剂盒提供的各种参数不一致时，说碗这个检测结果不准确，需进一步对这些检理整数掘进行验证。10. 1 交叉反应检滤一个特定的目标蛋白，雾分析其在不同基质中反应的辛辛异性a可以用吕标蛋白的类似物即具有幸在似序列的蛋白来评价交叉反应，向对也要对含有成分尽可能相近的非转基因祥品进行检验和比较e10
14、.2 墓聂效应不同她基质所适湾的免疫检测范围不同，应明确基质的应用范离用与基质相一致的标准品，制作ilBI主标准品的事毒草事曲线，照子测试样品抢走量检溅，标准涵线始形状不应理基质效应而改变。如果样品与标准品在不同剖基震中透行检验，应考虑基质效应。10.3 线性率对于运量检测来说，应碗确不同基质免疫分析的线性范围。阳性标准品的检测数值在一定范自内应该是线性关系)la果出现蓝蓝线，应该事生吉思更多的限性标准品，获得更多标准点，创作标准些线；奴果应线斜率不相同，应对辛辛品稀薄和署署试，并进行统计分析。11 验证方法如果对检浓结果出现异议，可以用定性或定量PCR检测方法验证。12 检那报告4 检测报告
15、至少需包含以下信怠一一实验室样品的信怠3一一标明是定性或定量检源方法g定性检测下罢王g最高或最低定量检测的F限g取样去期、类型，i技丰羊g期p检测日期：苦毒试样品的数量；一一检测结果及所采用的数重单位p在检吉寄：中观察到的异常现象zE耳能对检测结果有影响，但在方法中未提到的操作或其他因素。GB月19495.在一2004附录A（规范性附录）转基i;i;J辘辘及其产品串CP4EPSPS蛋白始在LISA检章程A. 1 适爵范攘本附录规定了转黎国大豆及其初级加工产品中CP4EPSPS蛋白的ELISA方法，也适用于含有CP4 EPSPS蛋白的其他转基因植物检测。A.2 原理用直接酶联免疫吸撒分析(ELI
16、SA）方法捡到CP4EPSPS蛋白部原理主000A. 1窒00A.4所示z丫丫丫子l 单R:隆抗体$2 包被表面。注酶标板表面包被有特异的单克隆捕获扰体e自居A. 1 1一一抗赚52一一包被表面。注当加上测试样品时，擒获抗体与抗直在结合，未结合的祥品成分通过洗涤除去。l 辣椒过氧化酶gF 检测抗体33一一包被表窟。阁A.22 3 注：洗澡之后加入与辣根过氧化物酶偶联的多克隆抗体，该抗体可与CP4EPSPS蛋白的另一个抗原表位特异结合。阁A.3 5 GB/T 19495. 8-2004 。O80 、气、，”一”I 包被表菌。注z洗涤之后，加入辣根过氧化物辈革的革色底物四原基联苯胶，H丘F可催化底
17、物产生颜色反应咽颜色信号与抗原浓度在定范遗内呈线注关系a显色定时间廷，加入终止液终止反应在450m波长然每孔的光密度。图A4A.3试Jf!JA. 3. 1 检测试剂盒通常提供的试剂A. 3. 1. 1 大豆刻提缓冲液z辍酸锦缓冲液，pH7.5。A. 3. 1. 2 大豆分析缓冲滚z磷酸盐缓冲液，ween-20,BSA. pH 7. 4。A. 3. 1. 3 包被有单克隆捕获抗体的酶标孔。A. 3. 1. 4 与辣被过氧化物酶偶联主号兔抗。A. 3. 1. 5 织联抗体稀释if!J,10 %热灭活的小鼠应清eA. 3. 1. 6 显色j去物会A. 3. 1. 7终止滚z0. 5%硫酸cA.3.1
18、.8 10倍浓缩的洗涤缓冲液，PBS,Tween 20, pH 7. L A. 3. 1. 9 与基质匹配的饲性和阳性标准品，如0.1%0. 5 % 1 % 2 % 5 % , A.3. 2 其他需要准备的试)11A.3.2. 1 70%的甲董事溶液（体积比）：滚700mL Efl醇加水定容至11，。A. 3. 2. 2 90%的乙董事aA.4 仪器设备A. 4. 1 通常实验室仪器设备aA. 4. 2 酶标仪9A. 4. 3 孔径450f阻的主主膜A. 4. 4 孔径150fID的草草膜。A. 4. 5 多通道移液器。A.5 操作步骤A. 5. 1 样品的预处理取50号g以上大豆粉碎、微孔滤
19、膜过滤c在操作过程中小心避免污染，避免局部过熬。定性检测的数孔滤蹊孔径应为450m，保证孔径小子450m豹粉末质量占大豆辛辛品凌量的始刘以上定量检GB/T 1495.8-2004 泌的样品先用于L径为45口r丑的微孔滤骂莫过法后，再经孔径为：50m的微孔滤摸过法，过滤得到j的祥品量只要能满足检测要求却可，xf于其他类型的材料采用类似的方法处理在检jj!g不同批次样品之间应将处理大豆样品的所有设备进行彻底清洁。首先，尽可能涂去残留材料，然后用酒精洗涤两边用水彻底清洗，风子。同时，工作区应保持清洁，避免样品交叉污染。A.5.2 样品抽建溅试样品、阴性及阳性标准品在梅同条件下拍提两次。每一种标准品在
20、称量对按照含量由低到高的烦序进行、将每一种样品称；110. 5 g主凸.01 g.)i！（入15mL聚丙烯离心管中。为避免污染，在称量不同样品时，用酒精棉擦干净药匙并陈干，或使m次性药匙。向每个离心管中加4.5 mL抬提缓冲液c将缓冲液与管内物质剧烈混匀并旋涡振荡使之成为均一的混合物低法粉末和分离蛋白质需延长混合时阂，有时超过15min；全脂粉末容易混匀，不超过5 min) 0 4下5000g离心15由m小心吸取主清液于另一干净的聚丙烯离心管中，每管吸取ImL上清液。上清液OJ于28贮存，时间不超过24h在检i周前.！在大豆检jj!lj缓中液按照表儿：所列比例稀释样品溶液。基建大豆豆粉段路豆粉
21、一一分离蛋白A.5. 3 ELISA操作步骤A. 5. 3. 1 孵育表A.1 不同基质的稀释度稀革手度I 3CO I 3CO I 300 I I 在室摇下，取出爵标板，如100丢，L乎每释的样品溶液及对照到酶标孔中，轻轻混匀。37辉育1h（每次力H样应该更换一次性吸头，以免交叉污染。并使用呈交带或铝？连封住酶标板，以免交叉污染和蒸发）。A. 5. 3. 2 洗涤把10倍浓绪的法涤缓冲滚泪水稀释10倍，用洗涤工作液没涤酶标板3次。在此过程中，不要让蔚标孔于，否则会影响分析结果g不管是人I洗涤还是自动洗涤，应确保每一孔用把同体积的法液流涤，以免出现错误的结果。人工一洗涤将酶标板翻转倒出微孔内液体
22、G用装有洗涤工作液的罚。mL浅瓶，将每孔注满洗法滚，保持60矢，然后吉普转，但j掉洗涤滚c主自此重复操作总共3次二在多层纸巾主将离标毅倒指数次，以去除残；在（用胶带将鹤标极条固定以免滑落） 自动洗去量费号育元毕，用洗毅机将所有子L中的液体吸出然后在每孔内加满洗涤液c如此重复3次。最后，用洗板机被出苦？有孔中洗涤在豆在多层纸巾上将酶标板反放抬干，以去在主残液aA.5.3.3 加入曹雪联抗体根据使用说明，用偶耳其抗体结合稀程剂济解抗体粉末得到主主体贮存罢王于28贮存。取240L j离联抗体贮存液，加入到21mL I骂联主在体稀释？延中得到偶联抗体工作液，于2c8贮存。在每fL中加100lL f属联
23、抗体工作；夜，封闭酶标板轻轻摇晃混匀.37孵育1h. A.5.3.4 没涤洗涤方法同人5.:J. 2 7 GB/T 19495. 8-2004 A.5. 3.5墨色每孔中细入10部L显色底物，轻轻摇动喜事标板，室温孵育lOmin（加墨色底物时应连续一次完成，不得中断，并保持相同次序和时i苟同商）。A. 5. 3.6 终止反应按照加人显色底纷向祥的烦序肉酶标孔中加入100l，终生液，轻轻摇动酶标板10s，以终止颜色变化，并使终止贯主在孔中均匀分布在加入终止液对应连续一次完成不得中断，酶标毅应注意避光，防止颜色深浅因受到光的影确而发生变化人A. 5. 3. 7 吸光筐的测定在加入终止液3号min之
24、内用酶标仅在450n四波长测量每孔的吸光值（D)。记录所得结果，用计算机软件处理eA. 6流程理蛋白质抽提流程见表A.2,ELISA实验流程；在表A.30 表A.2蛋白质抽提流程程序详绍说明辛辛量称重0.5 g测试样品、空白、参要在标准E力E缓冲液加人拍卖理冲？在（A.3. l. 1)4. 5 mL。建主匀使浏试季军品与拍提缓冲贯主充分混匀，高脂粉末低于三min,1JU旨奉告末毛分离蛋白羡15min以主。离心在，c以5080 g将祥品离心l5min，吸取上清滚到另干革离心管中。稀释根据基震不同（l 3CO或l 10稀释穗释溅试样品溶接、空白、阴性和阳性标准品。表A.3ELISA实验流程程序i丰
25、积详细说窃加祥JOO L 数量移被器吸取己稀释约样品落滚、空白、阴性和m性标准品至梧应酶标孔。孵育:17孵曹isi5t海用洗涤缓冲滚（A.3. I. 8）洗捺3泼。力E样l !JO L 向每个爵标孔中沁人偶联抗体（A、3.I.的。孵育37姆育l人洗涤用洗古草缓J中液（A3.l.8li世涤3次9加辛辛 100 lL i司每个重草标孔中主器人显色底物（A.3.l.6）。孵育室温解青18四io,力E得JOO L i司每卡塞每孔中加入终止液飞A.3.l.7J。i！匀轻轻浸匀JOs. 测量极光度F在酶在主IX.iifil量每孔在全50nm剖吸光度否A. 7 测试祥品中吕辛辛、蛋白浓度的计算i核试样品及参
26、照标准的数值需减去空忠祥的数值所测量的限俭标准品的平均值用于生成标准自线，测试样品的孚均值根据标准曲线计算梧应浓度。8 GB/T 19495. 8-2004 A.8 结果穹信度判断的原则对于阳性标准品大豆种子而言，该方法检测的灵敏度必须保证在认1%以上，定量检泌的线性范围是0.5%3%。每一轮检测都必须符合表A.4所列的结果可信度判断的原则。每轮反应应当包括空白、阴性标准品、限性标准品和满试样品e所有样品检测液、空白对照都必须设置一个重复如果不符合表A.4 中所列的条件，所有检测实验需重新操作。表A.4结果可信度到额的条件空白对照OD，丑dmeans hy !CR Method and lmmunoaay Kits Jo盯nalof Food and Drug Analysis. 2001,9(3), 160 16岳
