1、ICS 67050X 04 囝雪中华人民共和国国家标准GBT 2350 12009食品中T一2毒素的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法Determination of T一2 toxin in food-High performanceliquid chromatographic method with immunoaffinity column cleanup2009-04-08发布 2009050 1实施丰瞀徽鬻瓣警糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会仅19刖 吾GBT 235012009本标准的附录A为资料性附录。本标准由全国食品工业标准化技术委员会(SACTC 64)提出。本标准由全国食
2、品工业标准化技术委员会食品通用检测技术分技术委员会(SACTC 64SC 8)归口。本标准起草单位：青岛市产品质量监督检验所、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中检维康技术有限公司、青岛啤酒股份有限公司。本标准主要起草人：张辉珍、李惠颖、王晓滨、郝俊光、鲍蕾、孙霄洁、王雄。食品中T-2毒素的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法GBT 2350120091范围本标准规定了食品中T一2毒素含量的免疫亲和层析净化高效液相色谱测定方法。本标准适用于粮食和粮食制品、酒类、酱油、醋、酱及酱制品中T_2毒素含量的测定。本标准的方法检出限：粮食和粮食制品的检出限为10 pgkg，酒类的检出限为5 pgkg，酱
3、油、醋、酱及酱制品的检出限为5 pgkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682 2008，ISO 3696：1987，MOD)3方法提要用提取液提取试样中的T-2毒素，经免疫亲和柱净化、1一蒽腈衍生化后，用高效液相色谱荧光检测器测定，外标法定量。4试剂和材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为符合GB
4、T 6682规定的一级水。41甲醇：色谱纯。42乙腈：色谱纯。43提取液：甲醇+水(80+20)。44 4-二甲基氨基吡啶(DMAP)：0325 gL。称取0032 5 g 4-二甲基氨基吡啶，用甲苯溶解并定容至100mL。45 i-蒽腈(1一anthroylnitrile，1-AN)：03 gL。称取0030 g 1-蒽腈，用甲苯溶解并定容至i00 mL。46 T_2毒素标准品：纯度98。47 T一2毒素标准储备液：准确称取一定量的T-2毒素标准品，用乙腈溶解，配成01 mgmL的标准储备液，在一20避光保存，可使用3个月。48 T-2毒素标准工作液：根据使用需要，准确吸取一定量的T_2毒素
5、标准储备液，用乙腈稀释，分别配成相当于5 ngmL、10 ngmL、50 ngmL、100 ngmL、200 ngmL的标准工作液，4保存，可使用7 d。49 T-2毒素免疫亲和柱。410玻璃纤维滤纸：直径11 cm，孔径15 pm，无荧光特性。5仪器和设备51天平：感量0001 g。52高效液相色谱仪：配有荧光检测器。1GBT 23501200953高速万能粉碎机：转速10 000 rmin。54均质器：转速大于10 000 rmin。55涡旋混合器。56玻璃注射器：10 mL。57氮气吹干仪。58试验筛：1 mm孔径。59空气压力泵。510超声波发生器：功率大于180 W。6分析步骤61试
6、样的制备与提取611粮食和粮食制品：将样品研磨，硬质的粮食等用高速万能粉碎机磨细并通过试验筛(58)，不要磨成粉末。称取25 g(精确到001 g)磨碎的试样于容量瓶中，用提取液(43)定容至1000 mL，混匀，转移至均质杯中，高速均质2 min。定量滤纸过滤，移取100 mL滤液于50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀，用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，收集滤液A于干净的容器中。612酒类：取脱气酒类试样(含二氧化碳的酒类样品使用前先置于4冰箱冷藏30 min，过滤或超声脱气)或其他不含二氧化碳的酒类试样20 g(精确到001 g)于50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混匀，定量滤纸过滤，
7、移取100 mL滤液于50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀，用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，收集滤液B于干净的容器中。613酱油、醋、酱及酱制品：称取25 g(精确到001 g)混匀的试样，用甲醇定容至500mL，超声提取10 min，定量滤纸过滤，移取100 mL滤液于50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀，用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，收集滤液c于干净的容器中。62净化将免疫亲和柱连接于玻璃注射器(56)下，准确移取61中的滤液A或B或C100mL，注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力，使溶液以约1滴s的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中。再用10 mL水淋
8、洗免疫亲和柱，流速约为1滴s-2滴s，直至空气进入亲和柱中，弃去全部流出液，抽干小柱。63洗脱准确加入1omL甲醇洗脱，流速约为1滴s，收集全部洗脱液D于干净的玻璃试管中。64衍生641 T2毒素标准工作液的衍生：取不同浓度的T-2毒素标准工作液各1 mL，在50下用氮气吹干，加入50 pL 4-二甲基氨基吡啶(DMAP)溶液(44)和50 pLl一蒽腈(1一AN)溶液(45)，在涡旋混合器上混匀1 rain，50反应15 min，在冰水中冷却10 min后取出，50下氮气吹干，用10 mL流动相(65)溶解，HPLC测定。642样品的衍生：将洗脱液D在50下用氮气吹干，按641步骤进行。65
9、高效液相色谱参考条件a) 色谱柱：C18柱，5 pm，150 mm46 mm或相当者；b) 流动相：乙腈+水(75+25)；c)流速：10 mLmin；d)柱温：35e)进样量：20 pL；f)检测波长：激发波长381 nm，发射波长470 nm。2(；BIT 23501200966定量测定以T-2毒素标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积积分值为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对试样进行定量，标准工作溶液和试样溶液中T_2毒素的响应值均应在仪器检测线性范围内。在上述色谱条件下，T-2毒素标准品色谱图参见图A1。67空白试验除不加试样外，空白试验应与测定平行进行，并采用相同的分析步骤。68
10、平行试验按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。7结果计算试样中T一2毒素的含量按式(1)计算!二鱼2丕!丕!QQ!m1 000式中：x试样中T-2毒素的含量，单位为微克每千克(pgkg)；Cl试样溶液中T-2毒素的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；CO空白试样溶液中T一2毒素的浓度，单位为纳克每毫升(ngmL)；V衍生化后甲醇定容体积，单位为毫升(mL)；m试样的质量，单位为克(g)；，一稀释倍数。检测结果以两次测定值的算术平均值表示。计算结果表示到小数点后1位。8回收率添加浓度在10 pgkg100 tugkg时，回收率在80110之间。9重复性在重复性条件下，获得的T_2毒素的两次独立测试结果的绝对差值不大于其算术平均值的10。GBT 235012009附录A(资料性附录)I-2毒素标准品的液相色谱图图A1 I-2毒素标准品的液相色谱图蚴伽啪
