1、ICS 67050X 04 a雪中华人民共和国国家标准GBT 23503-2009食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法Determination of deoxynivalenol in food-High performanceliquid chromatographic method with immunoaffinity column cleanup2009-04-08发布 20090501实施丰瞀鹳紫瓣警雠瞥星发布中国国家标准化管理委员会仪19刖 吾GBT 23503-2009本标准的附录A为资料性附录。本标准由全国食品工业标准化技术委员会(SACTC 64)提
2、出。本标准由全国食品工业标准化技术委员会食品通用检测技术分技术委员会(SACTC 64SC 8)归口。本标准起草单位：青岛市产品质量监督检验所、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中检维康技术有限公司、青岛啤酒股份有限公司。本标准主要起草人：张辉珍、王晓滨、单连菊、吴振兴、林艳、李惠颖、王雄。食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法GBT 23503-20091范围本标准规定了食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量的免疫亲和层析净化高效液相色谱测定方法。本标准适用于粮食和粮食制品、酒类、酱油、醋、酱及酱制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量的测定。本标准的方法检出限：粮食和粮食制品的检出限为0
3、5 mgkg，酒类的检出限为01 mgkg，酱油、醋、酱及酱制品的检出限为01 mgkg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 6682分析实验室用水规格和试验方法(GBT 6682-2008，ISO 3696：1987，MOD)3方法提要用提取液提取试样中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇，经免疫亲和柱净化后，用高效液相色谱紫外检测器测定，外标法定量。4试剂和材料除另有
4、说明外，所用试剂均为分析纯，水为符合GBT 6682规定的一级水。41甲醇：色谱纯。42乙腈：色谱纯。43聚乙二醇(相对分子质量8 000)。44 PBS清洗缓冲液：称取80 g氯化钠、12 g磷酸氢二钠、02 g磷酸二氢钾、02 g氯化钾，用990 mL水将上述试剂溶解，然后用浓盐酸调节pH至70，再用水稀释至1 L。45脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准品：纯度98。46脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准储备液：准确称取一定量的脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准品，用甲醇溶解，配成01 mgrnL的标准储备液，在一20保存，可使用3个月。47脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准工作液：根据使用需要，准确吸取一定量的脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准储
5、备液，用流动相稀释，分别配成相当于01-gmL、02 ggmL、05LgmL、10 pgmL、20 ttgmL、50 ktgmL的标准工作液，4保存，可使用7 d。48脱氧雪腐镰刀菌烯醇免疫亲和柱。49玻璃纤维滤纸：直径11 cm，孔径15 pm。5仪器和设备51天平：感量0001 g。52高效液相色谱仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器。53均质器：转速大于10 000 rrain。1GBT 23503-200954高速万能粉碎机：转速10 000 rmin。55玻璃注射器：10 mL。56试验筛：l mm孔径。57空气压力泵。6分析步骤61试样制备与提取611粮食和粮食制品：将样品研磨，硬
6、质的粮食等用高速万能粉碎机磨细并通过试验筛(56)，不要磨成粉末。称取25 g(精确到001 g)磨碎的试样于100 mL容量瓶中加入5 g聚乙二醇(43)，用水定容至刻度，混匀，转移至均质杯中，高速搅拌2 rain。定量滤纸过滤后以玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，收集滤液A于干净的容器中。612酒类：取脱气酒类试样(含二氧化碳的酒类样品使用前先置于4冰箱冷藏30 rain，过滤或超声脱气)或其他不含二氧化碳的酒类试样20 g(精确到001 g)，加入1 g聚乙二醇(43)，用水定容至250 mL，混匀，用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，收集滤液B于干净的容器中。613酱油、醋、酱及酱制品：取样品25
7、 g(精确到001 g)，加入5 g聚乙二醇(43)，用水定容至1000 mL，高速搅拌提取2 min。定量滤纸过滤后，用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，收集滤液C于干净的容器中。62净化将免疫亲和柱连接于玻璃注射器(55)下，准确移取61中滤液A或B或C 20 mL，注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力，使溶液以约1滴s的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中。用5 mL PBS清洗缓冲液(44)和5 mL水先后淋洗免疫亲和柱，流速约为1滴s2滴s，直至空气进入亲和柱中，弃去全部流出液，抽干小柱。63洗脱准确加入10mL甲醇洗脱，流速约为l滴s，收集全部洗脱液于干净的玻璃
8、试管中，HPLC测定。64高效液相色谱参考条件a)色谱柱：C，8柱，5 pm，150 minx46 mm或相当者；b)流动相：甲醇+水(20+80)；c)流速：o8 mLmin；d)柱温：35；e) 进样量：50 pL；f)检测波长：218 nm。65定量测定以脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准工作液浓度为横坐标，以峰面积积分值为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对试样进行定量，标准工作溶液和试样溶液中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的响应值均应在仪器检测线性范围内。在上述色谱条件下，脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准品色谱图参见图A1。66空白试验除不加试样外，空白试验应与测定平行进行，并采用相同的分析步骤。67平行试验按
9、以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。7结果计算试样中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量按式(1)计算2X co)V1000m1 000GBT 23503-2009式中：x试样中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量，单位为毫克每千克(mgkg)；c-试样溶液中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的浓度，单位为微克每毫升(pgmL)；“空白试样溶液中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的浓度，单位为微克每毫升(tgmL)V甲醇洗脱液体积，单位为毫升(mL)；m试样的质量，单位为克(g)；，稀释倍数。检测结果以两次测定值的算术平均值表示。计算结果表示到小数点后1位。8回收率添加浓度在05 mgkg20 mgkg时，回收率在70100之间。9重复性在重复性条件下，获得的脱氧雪腐镰刀菌烯醇的两次独立测试结果的绝对差值不大于其算术平均值的10。GBT 23503-2009附录A(资料性附录)脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准品的液相色谱图图A1 脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准品液相色谱图
