1、a雪中华人民共和国国家标准GBT 23535-20092009-04-27发布脂肪酶制剂Lipase preparations20091 1-01实施宰瞀髁紫瓣訾矬赞星发布中国国家标准化管理委员会况1”前 言本标准以QB 180541993工业用脂肪酵制剂为基础制定。本标准的附录A为资料性附录。本标准由中国轻工业联合会提出。本标准由全国食品工业标准化技术委员会工业发酵分技术委员会归口。本标准起草单位：中国食品发酵工业研究院、诺维信(中国)生物技术有限公司。本标准主要起草人：张蔚、郑海峰、郭新光、唐辰、曹振宇、康忆隆。GBT 23535-2009脂肪酶制剂GBT 23535-20091范围本标准
2、规定了脂肪酶制剂的术语和定义、产品分类、要求、试验方法、检验规则和标志、包装、运输、贮存。本标准适用于以淀粉质(或糖质)为原料，经微生物发酵、提纯制得的中性脂肪酶制剂的生产、检验和销售。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注El期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 191包装储运图示标志(GBT 191-2008，ISO 780：1997，MOD)GBT 601化学试剂标准滴定溶液的制备GBT 6
3、03化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备(GBT 603-2002，ISO 63531：1982，NEQ)3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。31脂肪酶lipase能水解甘油三酯或脂肪酸酯产生单或双甘油酯和游离脂肪酸，将天然油脂水解为脂肪酸及甘油，同时也能催化酯合成和酯交换反应的酶。32脂肪酶活力activity of lipase脂肪酶活力以脂肪酶活力单位表示，定义为1 g固体酶粉(或1 mL液体酶)，在一定温度和pH条件下，1 rain水解底物产生1 pmol的可滴定的脂肪酸，即为1个酶活力单位，以ug(umL)表示。4产品分类41按产品的应用领域A类产品食品工业和饲料工业用酶制剂。
4、B类产品其他工业用酶制剂。42按产品形态固体剂型酶制剂和液体剂型酶制剂。5要求51外观固体剂型：白色至黄褐色粉末或颗粒，无绪块、无潮解现象。无异味。有特殊发酵气味。液体剂型：浅黄色至棕褐色液体，允许有少量凝聚物。无异味。有特殊发酵气味。1GBT 23535-200952理化要求应符合表1的规定。表1脂肪酶制剂的理化要求项 目 固体剂型 液体剂型酶活力lulmL(或ug) 5 000干燥失重- 808可按供需双方合同规定的酶活力规格执行。b不适用于颗粒产品。53卫生要求应符合国家有关规定。6试验方法除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。61外观称取样品10 g(
5、或10 mL)，观察、嗅闻作出判断，做好记录。62酶活力621原理脂肪酶在一定条件下，能使甘油三酯水解成脂肪酸、甘油二酯、甘油单酯和甘油，所释放的脂肪酸可用标准碱溶液进行中和滴定，用pH计或酚酞指示液指示反应终点，根据消耗的碱量，计算其酶活力。反应式为：RCOOH+NaOH，RCOONa+H20注1：酯酶的存在会使检测的脂肪酶的活力增加。蛋白酶的存在会降解脂肪酶，从而使检测到的脂肪酶的活力减小。注2：洗涤剂的存在会严重影响本方法。依不同洗涤剂的类型和浓度不同，这种影响表现为从完全抑制到激活。注3：酶会附着在塑料上，因此应用玻璃器皿溶解稀释，同时也应用玻璃器皿滴定。在溶液的转移中如果时间很短，且
6、选择适当的塑料材质，可以使用塑料移液枪头。622仪器和设备6221分光光度计。6222恒温水浴：精度土02。6223自动移液器。6224高速匀浆机。6225 pH计：精度为001pH单位。6226电磁搅拌器。6227微量滴定管：10 mL，分刻度o05 mL。623试剂和溶液6231 聚乙烯醇(PVA)：聚合度1 750土50。6232橄榄油：试验试剂。6233 95(体积分数)乙醇。6234底物溶液：称取聚乙烯醇(PVA)(6231)40 g(精确至o1 g)，加水800 mL，在沸水浴中加热，搅拌，直至全部溶解，冷却后定容至1 000 mL。用干净的双层纱布过滤，取滤液备用。量取上述滤液1
7、50 mL，加橄榄油50 mL，用高速匀浆机处理6 rain(分两次处理，间隔5 rain，每2GBT 23535-2009次处理3 min)，即得乳白色PVA乳化液。该溶液现用现配。6235磷酸缓冲溶液(pH一75)：分别称取磷酸二氢钾196 g和十二水磷酸氢二钠3962 g，用水溶解并定容到500 mL。如需要，调节溶液的pH到75士005。6236氢氧化钠标准溶液Ec(NaOH)一o05 toolL3：按GBT 601配制与标定。使用时，准确稀释10倍。6237酚酞指示液(10 gL)：按GBT 603配制。624分析步骤6241待测酶液的制备称取酶样品1 g2 g，精确至0000 2
8、g，用磷酸缓冲液(6235)溶解并稀释。如果样品为粉状，可用少量磷酸缓冲液溶解后用玻璃棒捣研，然后将上清液小心倾入容量瓶中。若有剩余残渣，再加少量磷酸缓冲液充分研磨，最终样品全部移入容量瓶中，用磷酸缓冲液定容至刻度，摇匀，转入高速匀浆机组织捣碎机捣研3 min后供测定。测定时控制酶液浓度，样品与对照消耗碱量之差控制在1 mL2 mL范围内。吸取样品时，应将酶液摇匀后再取。6242测定62421 电位滴定法(第一法)a)按pH计使用说明书进行仪器校正；b)取两个100 mL烧杯，于空白杯(A)和样品杯(B)中各加人底物溶液(6234)400 mL和磷酸缓冲液500 mL，再于A杯中加入95乙醇(
9、6233)1500 mL，于40士02水浴中预热5 rain，然后于A、B杯中各加待测酶液100 mL，立即混匀计时，准确反应15 min后，于B杯中立即补加95乙醇1500 mL终止反应，取出；c)在烧杯中加入一枚转子，置于电磁搅拌器上，边搅拌，边用氢氧化钠标准溶液(6236)滴定，直至pill03，为滴定终点，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积。62422指示剂滴定法(第二法)a)取两个i00 mL三角瓶，分别于空白瓶(A)和样品瓶(B)中各加入底物溶液400 mL和磷酸缓冲液500 mL，再于A瓶中加入95乙醇1500 mL，于404-O2水浴中预热5 rain，然后于A、B瓶中各加待测酶液
10、100 mL，立即混匀计时，准确反应15 min后，于B瓶中立即补加95乙醇150mL终止反应，取出；b)于空白和样品溶液中各加酚酞指示液两滴，用氢氧化钠标准溶液滴定，直至微红色并保持30 s不褪色为滴定终点，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积。6243计算脂肪酶制剂的酶活力按式(1)计算：x，；盟_2桨丕旦丕旦1 (1)UUo o式中：x。样品的酶活力，ug,y。滴定样品时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，单位为毫升(mL)；v2滴定空白时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，单位为毫升(mL)；r一氢氧化钠标准溶液浓度，单位为摩尔每升(toolL)；50o05 molL氢氧化钠溶液100 mL相当于脂肪酸50
11、 ttm01)nt样品的稀释倍数；005氢氧化钠标准溶液浓度换算系数；1壶反应时间15 min，以1 min计。3GBT 23535-2009所得结果表示至整数。625精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的2。63干燥失置631仪器6311电热干燥箱。6312分析天平；精度为0000 1 g。6313称量瓶：50 mm30 miD-。632分析步骤用烘干至恒重的称量瓶称取酶样约2 g，精确至士o000 2 g，置于103-t-2电热干燥箱中，将盖取下，侧放在称量瓶旁，烘干2 h，取出，加盖，放人干燥器中冷却至室温，称量。633计算干燥失重按式(2)计算：X2：
12、m1-m2100 m1m式中：x：样品的干燥失重，；m。一干燥前称量瓶加样品的质量，单位为克(g)；m。干燥后称量瓶加样品的质量，单位为克(g)；m称量瓶的质量，单位为克(g)。所得结果表示至一位小数。7检验规则71批次的确定由生产单位按照其相应的规则负责确定产品的批号，批内产品的品质应均一。72取样规则和样本量721取样应均匀分布在整个灌装过程中，或均匀分布于灌装后的成品中。722取样时应采用适宜的方法保证取样具有代表性，保证取样部位和取样瓶的清洁。对用于微生物检验的取样，应使用无菌操作。723成品抽样的样本量见表2。取样的样本量可按照估计的批量参照表2执行，或由生产企业和(或)相关方确定。
13、批取样量不得少于300 mL(或300 g)，不足者应按比例适当加取。表2成品抽样的样本量批量桶或箱 样本量桶或袋500 4注：批量是指批中所包含的单位商品数，单位为桶或箱。样本量是指样本中所包含的样本单位数，单位为桶或袋。73检验分类731出厂检验7311产晶出厂前，应由生产厂的质量监督检验部门按本标准规定逐批进行检验，检验合格，并附上质量合格证明的，方可出厂。4GBT 23535-20097312检验项目：外观、酶活力、干燥失重(固体)和A类产品的菌落总数。732型式检验7321检验项目：本标准中全部要求项目。7322一般情况下，同一类产品的型式检验每年至少进行一次，有下列情况之一者，亦应
14、进行：a)原辅材料有较大变化时；b)更改关键工艺或设备时；c)新试制的产品或正常生产的产品停产3个月后，重新恢复生产时；d) 出厂检验与上次型式检验结果有较大差异时e) 国家质量监督检验机构按有关规定需要抽检时。74判定规则741 出厂检验和(或)型式检验合格时，由质量检验部门出具产品合格证。742出厂检验和(或)型式检验不合格时，在原批次基础上加倍取样分析。如仍不合格，判定该产品为不合格品，不得出厂。8标志、包装、运输夏贮存81标志811产品的外包装宜使用符合GBT 191要求的标志。812产品的包装上应贴有牢固的标签。标志内容应包括品名、产地、厂名、规格(酶活力)、生产日期、批号或代号、保
15、质期等。82包装产品的内包装和(或)包装容器的内涂料应采用国家批准的材料，A类产品应符合相应的食品包装用食品容器卫生标准的材料。83运输产品在运输过程中应轻拿轻放，严防雨淋和曝晒。运输工具应清洁、无毒、无污染。严禁与有毒、有害、有腐蚀性的物质混装混运。84贮存产品应贮存在阴凉干燥的环境下。严禁与有毒、有害、有腐蚀性的物质同存。9保质期9I在冷藏48条件下，液体酶制剂保质期不少于90天；在25下，固体酶制剂保质期不少于180天，企业应按上述要求具体标示。保质期内实测酶活力不应低于标示酶活力。92酶制剂是含有生物活性物质的产品。在保质期外，保存期内，酶活力可能降低，但仍具有使用价值。GBT 235
16、35-2009附录A(资料性附录)动态滴定法测定脂肪酶的酶活力A1范围本方法适用于测定含有或混有脂肪酶酯酶样品中的脂肪酶活力。特殊的脂肪酶或特殊的成品制剂在样品制备阶段需采用特殊的稳定或抽提手段以保证检测到所有的脂肪酶活力。A2原理脂肪酶水解甘油三酯生成脂肪酸，使反应体系的pH不断下降。通过连续加入碱的方法保持反应体系的pH恒定。碱滴定的速率与酶活力成比例。注1：酯酵的存在会使检测的脂肪酶的活力增加。蛋白酶的存在会降解脂肪酶，从而使检测到的脂肪酶的活力减小。注2：洗涤剂的存在会严重影响本方法。依不同洗涤剂的类型和浓度不同，这种影响表现为从完全抑制到激活。注3：酶会附着在塑料上，因此应用玻璃器皿
17、溶解稀释，同时也应用玻璃器皿滴定。在溶液的转移中如果时间很短，且选择适当的塑料材质，可以使用塑料移液枪头。A21反应式RC00CCH2CH2CH3 C心OH腊肪酶HC00CCH2CH2CHa HCOOCC地CH2CH3 +CH3cH2cH2COOHH2COOCCH2cH2CFI, H2COOCc托CH2CH3三丁酸甘油酯 二丁酸甘油酯 丁酸A22反应条件温度：30士1。pH：7OO。底物浓度：016 molL的三丁酸甘油酯。反应时间：至少15 rain(只有线性反应区用于计算斜率)。A23分析范围样品的分析范围是02 umL40 umL。如果可能，所有样品应在15 umL40 umL的范围内被
18、分析。A24检测限对于液体样品检测限为20 ug，相当于25 g样品溶解在10 mL溶液中，然后再稀释25倍。对于固体样品检测限为50 ug，相当于10 g样品溶解在10 mL溶液中，然后再稀释25倍。A3仪器和设备A31 具有动态滴定(pHstat)功能的滴定仪。在动态滴定仪中还要注意选择适当的pH电极(对pH值响应快)和滴定分配样品准确(特别是滴定氢氧化钠)。还要选择玻璃滴定容器(带水浴夹套)和有效的搅拌器(棒状螺旋搅拌器优于磁力搅拌)，这样才构成完整的系统。6GBT 23535-2009A32乳化器。A33恒温水浴：精度士02。A34温度计：精度士02。A35自动移液器。A4试剂除非另有
19、说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。A41三丁酸甘油酯(c。；H。06)。A42氯化钠(NaCl)。A43磷酸二氢钾(KHzPq)。A44阿拉伯胶。A45甘氨酸(H。NCH。COOH)。A46甘油HOCH：CH(OH)CHzOH。A47氢氧化钠片剂(NaOH)。A48电极校正液(pH 7o)。A49电极校正液(pH 401)。A410 96乙醇。A411氮气(N2)。A412氢氧化钠溶液c(NaOH)=1 molL：按照GBT 601配制。A413 氢氧化钠滴定液c(NaOH)一0025 toolL：取上述溶液25 mL，用水稀释并定容到l 000mL。配好
20、后需用适宜的设备脱气。A414氢氧化钠滴定液c(NaOH)一o005 toolL：取氢氧化钠滴定液(A413)25 mL，用水稀释并定容到5 000mL。A415乳化剂：分别称取阿拉伯胶300 g、氯化钠537 g和磷酸二氢钾120 g。量取甘油1 620 mL。将大约180 mL去离子水倒人400 mL的烧杯中，加入搅拌子，开始高速搅拌，将阿拉伯胶缓慢倒入水中，不断搅拌直至全部溶解。将称好的氯化钠和磷酸二氢钾转入到3 L容量瓶中，加350 mL水充分搅拌直至完全溶解，将甘油全部加入。将阿拉伯胶溶液转入容量瓶中，充分搅拌后用水定容。A416底物乳剂：称取三丁酸甘油酯625 g，分别量取乳化剂(
21、A415)200 mL和水940 mL，混合。将混合液匀浆器处理3 min(7 000 rrain)。匀浆后的溶液先用普通的磁力搅拌搅拌至少20 min，然后调节pH到475005。不同来源和批号的三丁酸甘油酯和阿拉伯胶对试验结果有影响，在更换产品或批号前需进行有效性确认。A417甘氨酸缓冲液1(751 gL)：称取甘氨酸3754 g和氢氧化钠片剂185 g，用水溶解并定容到5 L。如需要，调节溶液的pH到108土005。A418甘氨酸缓冲液2(075 gL)：取100 mL上述甘氨酸缓冲液1，用水定容到1 000 mL。如需要，调节溶液的pH到108士005。A5标准曲线和样品处理A51标准
22、曲线称取一定量的已知活力酶标准品，精确到0000 1 g。然后用甘氨酸缓冲液2(A418)溶解并稀释，制成标准储备液。标准储备液的浓度为20 umL。然后按照表A1配制溶液，并绘制标准曲线。7GBT 23535-2009表A1标准曲线脂肪酶活力 标准储备液所用体积 用水定容至标准点(umL) mL1 0200 100 1002 0500 250 1003 1OOO 500 1004 2000 100 1005 3000 150 1006 4000 200 100A52标准对照可使用已知活力的样品作为标准对照。标准对照的处理同样品。A53样品处理不同的样品需做不同的预处理，以激活或保护在样品基质
23、中的脂肪酶。可考虑采用甘氨酸缓冲液1(A417)和水来分别溶解和稀释样品的方法，或甘氨酸缓冲液2来溶解和稀释样品的方法，或直接用水溶解和稀释样品的方法，以求得到最好的效果。样品的溶解液和稀释液应充分搅拌均匀。样品应最终稀释到酶活力在15 umL40 umL范围内。如可能，样品稀释完应立即测定。A6分析步骤A61系统准备按照无水乙醇、适当的肥皂水、热水、去离子水、底物的顺序清洗滴定容器和管路。保证水浴的温度在30005。校正pH电极：每天使用前要校正pH电极的灵敏度在95102；pH700应在69856989之间；pH401应在40094012之间。如果达不到此标准，按照pH电极使用说明进行冲洗
24、并再次校正。A62分析pH电极用后浸泡在饱和的氯化钾(Kcl)溶液中，使用前冲洗。在反应溶液表面用氮气吹充，以防止空气中二氧化碳的干扰。分析前一定要保证底物的温度为300士05。在分析每个样品前要用0005 molL的氢氧化钠溶液(A414)冲洗滴定皿和管路。试验步骤如下：将15 mL的底物加入到滴定皿中。滴定前pH电极的读数应小于70。加1 mL样品稀释液加入到滴定皿中。反应体系的pH在滴定过程中保持在70。记录为保持恒定pH而加入的滴定液的量。滴定结束后滴定仪打印出滴定曲线线性范围的平均斜率(如果使用不同的设备，数据可能以其他形式输出)。滴定曲线应有一段持续15 rain的线性输出。先分析
25、标准曲线(每个标准点分析1次)，然后分析一个标准对照，再分析样品(每个样品分析1次)。重要的是一天之中非一次运行的样品不能使用相同的标准曲线。事先应知道每一次运行的样品的个数。如果样品在当天晚些时候分析，标准溶液要重新分析。每个样品分析前和最后一个样品完成分析后，系统将进行冲洗。排空底物容器和管路，并用乙醇冲洗。如果系统将会在l周以上时间不再使用，则需要用去离子水进行冲洗并用氢氧化钠8溶液(A414)或相同浓度的盐酸溶液充满敏感部件，避免出现盐类结晶。A7计算aBT 23535-2009A71结果计算利用标准点的测定值作标准曲线，其中x轴为标准品酶活力，Y轴为相应的滴定反应的平均斜率(mLmi
26、n)。标准曲线应该是一条直线。样品稀释液的活力从标准曲线中读出，然后按式(A1)计算： X3一AxV3X n2m3式中：x。样品的酶活力，ug；A稀释样品在标准曲线上读出的酶活力，umL；V。样品溶解用的容量瓶体积，单位为毫升(mL)；n。第二次稀释的倍数；m。样品的质量，单位为克(g)。A72结果的确认当满足以下条件时可以确认本次分析有效：标准对照的检测值在本方法所规定的可接受偏差范围内；标准曲线的斜率应满足：1)标准点1小于o02 mLmin；2)标准点6在014 mLmin018 mLmin之间；标准曲线的相关系数(r2)大于等于0995；标准点3点6的相关系数(r2)应大于0999 5。标准点12的r2大于0995是可接受的。如果达不到此条件，应检查分析系统。A73结果的表示结果给出3位有效数字。如果结果低于检测限，则表示为20 ug(液体)或50 ug(固体)。A8精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5。
