1、ICS 65.020.99 B 39 中华人民共和国国家标准GB/T 23599-2009 阜菇因种Pure culture of straw mushroom 2009-04-23发布中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会2009-09-01实施发布目。吕本标准的附录A、附录B、附录C和附录D均为规范性附录。本标准由中华全国供销合作总社提出并归口。G/T 23599-2009 本标准起草单位:广东省食用菌行业协会、广东省微生物研究所、广东粤微食用菌技术有限公司、农业部微生物肥料和食用菌菌种质量监督检验测试中心。本标准主要起草人:杨小兵、胡惠萍、吴清平、朱少琼、李森柱、
2、黄龙花、黄晨阳、廖世煌、张一帆、张金霞。I GB/T 23599-2009 草菇菌种1 范围本标准规定了草菇CVolvariellavolvacea)菌种的相关术语和定义、质量要求、试验方法、检验规则及标签、标志、包装、运输、贮存的要求。本标准适用于草菇菌种的生产、流通和使用。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 191 包装储运图示标志CGB/T191
3、-2008,IS0 780 :1 997 ,MOD) GB/T 4789.28-2003 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂GB/T 12728-2006 食用菌术语NY /T 528-2002 食用菌菌种生产技术规程3 术语和定义GB/T 12728-2006确立的以及下列术语和定义适用于本标准。3. 1 拮抗现象antagonism 具有不同遗传基因的菌落间产生不生长区带或形成不同形式线状边缘的现象。3.2 角变sector 因菌丝体局部变异或感染病毒而导致菌丝变细、生长缓慢、菌丝体表面特征成角状异常的现象。3.3 高温抑制线high-temperatured line 食用菌菌种在
4、生产过程中受高温的不良影响，培养物出现的圈状发黄、发暗或菌丝变稀弱的现象。4 质量要求4. 1 母种4. 1. 1 容器规格按NY/T528一2002中4.7.1.1的规定执行。4.1.2 感官要求应符合表1的规定。GB/T 23599-2009 项目容器棉塞或硅胶塞培养基灌入量斜面长度接种块大小(接种量)菌丝生长量菌丝体特征菌种外观菌丝体表面菌丝分泌物菌落边缘杂菌菌落斜面背面外观气味4. 1.3 微生物学要求应符合表2的规定。项目菌丝生长状态细菌和霉菌4. 1.4 菌丝生长速度表1母种感官要求要求完整，元损干燥、洁净、松紧适度，能满足透气和滤菌要求试管总容积的四分之一至五分之一顶端距棉塞或硅
5、胶塞40mm50 mm (3 mm5 mm) X (3 mm5 mm) 长满斜面淡白至黄白色、半透明、旺健、丰满、爬壁力强、气生菌丝旺盛、菌种表面允许有少量红褐色的厚垣抱子舒展、无角变元整齐无培养基不干缩，颜色均匀、元暗斑、无色素有草菇菌种特有的清香味，无酸、臭、霉等异昧表2母种微生物学要求要求粗壮、丰满，显微镜下观察，有直径注8m的粗壮菌丝，菌丝线形，分枝均匀，呈直角或近于直角元在PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)培养基上，在黑暗、适温(32oc士1OC)条件下，菌丝长满斜面的时间为3d., 5d 4.1.5 母种栽培性状供种单位所供母种需经出菇试验确认农艺性状和商品性状等种性合格后，方可用于扩大繁
6、殖或出售。产量性状在正常条件下，以采用附录B中提供的栽培培养基为例，生物学效率应不低于20%。4. 1. 6 菌丝可溶性蛋白电泳图谱特征电泳图谱在Rf二0.75(Rf为电泳条带的相对迁移率)处具染色很深的蛋白带。4. 1. 7 ITS(内部转录间隔区)序列特征供试菌株的ITS序列与草菇V23的ITS序列进行比对，相似性应达98%以上。4.2 原种4.2. 1 容器规格使用650mL., 750 mL且耐1260C高温的元色或近元色的玻璃菌种瓶，或850mL耐1260C高温白色半透明的塑料菌种瓶，或(13cm., 15 cm)X(26 cm., 28 cm)耐1260C高温的聚丙烯塑料袋，各类容
7、器都应使用棉塞或能满足滤菌和透气要求的元棉塑料盖。4.2.2 感官要求应符合表3的规定。2 项目容器棉塞或无棉塞塑料盖培养基上表面距瓶(袋)口距离接种量(每支母种接原种数，接种物大小)菌丝生长量菌丝体特征培养物表面菌丝体菌种外观培养基及菌丝体培养物表面分泌物杂菌菌落拮抗现象子实体原基气味4.2.3 微生物学要求应符合表2的规定。4.2.4 菌丝生长速度GB/T 23599-2009 表3原种感官要求要求完整，无损干燥、洁净、松紧适度，能满足透气和滤菌要求50 mm士5mm 4瓶(袋)6瓶(袋)，二三(12mmX 15 mm) 长满容器菌丝显淡白或灰白色，生长旺健、饱满，菌种表面允许有少量红褐色
8、的厚垣抱子元角变、无高温抑制线紧贴瓶壁、无干缩元无无元有草菇菌种特有的清香味，无酸、臭、霉等异味在适宜培养基上，在适温(32oc士1OC)条件下，菌丝长满容器的时间为7d,._, 12 d。4.3 栽培种4.3.1 容器规格按照4.2.1的规定执行。4.3.2 感官要求应符合表4的规定。表4栽培种感官要求项目要求容器完整，无损棉塞或无棉塞塑料盖干燥、洁净、松紧适度，满足透气和滤菌要求培养基上表面距瓶袋)口的距离50 mm士5mm 接种量每瓶(袋)原种接栽培种数30瓶(袋)50瓶(袋)菌丝生长量长满容器菌丝体特征菌丝显淡白或灰白色，生长旺健、饱满，菌种表面允许有少量红褐色的厚垣抱子不同部位菌丝体
9、生长齐整，色泽一致，无角变，无高温抑制线菌种外观培养基及菌丝体紧贴瓶(袋壁、元干缩培养物表面分泌物无杂菌菌落无拮抗现象元子实体原基元气味有草菇菌种特有的清香味，无酸、臭、霉等异味3 GB/T 23599-2009 4.3.3 微生物学要求应符合表2的规定。4.3.4 菌丝生长速度在适宜培养基上，在黑暗、适温(32oC :l: 1 OC)条件下，菌丝长满容器的时间为7d- 12 d。5 试验方法5. 1 感官检验按表5逐项进行。表5感官要求检验方法检验项目检验方法检验项目检验方法母种、原种肉眼观察、测量容器肉眼观察接种量栽培种检查生产记录硅胶塞、无棉塑料盖测量培养基上表面距瓶(袋)肉眼观察口的距
10、离母种培养基灌入量肉眼观察菌种外观各项肉眼观察(杂菌菌落除外)母种斜面长度测量杂菌菌落肉眼观察，必要时用5倍放大镜观察母种斜面背面外观肉眼观察气味鼻嗅5.2 微生物学检验5.2.1 表2中菌丝生长状态用放大倍数不低于10X40的光学显微镜对培养物的水封片进行观察，每一检样应观察不少于50个视野。5.2.2 细菌检验:取少量疑有细菌污染的培养物或菌块，按元菌操作接种于GB/T4789. 28-2003中4.8规定的营养肉汤培养液中，36oC ,._, 38 oC振荡培养1d，观察培养液是否混浊。培养液混浊，为有细菌污染;培养液澄清，为元细菌污染。5.2.3 霉菌检验:取少量疑有霉菌污染的培养物或
11、菌块，按元菌操作接种于PDA培养基(见A.1. 1) 中，25oC -28 oC培养3d,._, 4 d，出现白色以外色泽的菌落或非草菇菌丝形态菌落的，或有异味者为霉菌污染物，必要时进行水封片镜检。5.3 菌丝生长速度5.3.1 母种:按A.1.1或A.1.2的配方，32oC :l: 1 oC培养，计算长满试管所需天数。5.3.2 原种和栽培种:按A.2.1、A.2. 2的配方任选其一，在32oC士1oC培养，计算长满所需天数。5.4 菌丝可溶性蛋白电泳方法供试菌株先经3次继代培养，按附录C规定的PDY(马铃薯加富)液体培养基，32oC黑暗浅层培养10 d。取上层菌丝体于冰浴中匀浆，再于130
12、00 r/min，离心10min，上清液作为样品，采用聚丙酷胶凝胶电泳，Tris-甘氨酸缓冲系统，pH8.9，凝胶浓度8%。使用Mini-PROTEAN n板式电泳槽，点样量20L，于冰浴中以10mA/块电泳2h。用考马斯亮蓝R250染色(0.1%考马斯亮蓝的7%乙酸溶液), 用含7%乙酸的20%甲醇溶液固定脱色。5.5 ITS序列分析方法按照附录D进行操作。5.6 母种农艺性状和商品性状将被检母种制成原种、栽培种。按附录B规定的培养基配方，采用床架式栽培方法，制作15m2培养料，料厚度为8cm,-, 10 cm。接种后分三组(每组5m2)进行常规管理，根据表6所列项目，做好栽培4 GB/T
13、23599-2009 记录，统计检验结果。同时将该母种的出发菌株设为对照，做同样处理。对比二者的检验结果，以时间计的检验项目中，被检母种的任何一项时间较对照菌株推迟3d以上(含3d)者，为不合格;产量显著低于对照菌株者，为不合格;菇体外观形态与对照明显不同或畸形者，为不合格。表6母种栽培中农艺性状和商晶形状检验记录检验项目检验结果检验项目检验结果母种长满所需时间/d原种长满所需时间/d菌丝长满培养基料面所需时间/d总生物学效率/%出第一潮菇所需时间/d色泽、质地第一潮菇生物学效率/%菇形平均单产/Ckg/m2)菇体尺寸/mm5. 7 留样各级菌种都要留样备查，留样的数量应每个批号菌种3支(瓶、
14、袋)，于15oC ,. 20 oC下贮存，贮存期母种为90d，原种为15d，栽培种为15d。6 检验规则6. 1 抽样质检部门的抽样应具有代表性。母种按品种、培养条件、接种时间分批编号，原种、栽培种按菌种来源、制种方法和接种时间分批编号。按批随机抽取被检样品。母种、原种、栽培种的抽样量分别为该批菌种量的10%、5%、1%。但每批抽样数量不得少于10支(瓶、袋);超过100支(瓶、袋的，可进行两级抽样。6.2 判定规则按质量要求进行。检验项目全部符合质量要求时，为合格菌种，其中任何一项不符合要求，均为不合格菌种。技术指标全部或部分不符合要求，允许业者整改后申请复检一次，如仍不符合要求，则判此批产
15、品不合格。7 标签、标志、包装、运输、贮存7. 1 标签、标志7. 1. 1 产品标签每支(瓶、袋)菌种应贴有(印有清晰注明以下内容的标签za) 产品名称(如:草菇母种); b) 品种名称(如:粤草02); c) 生产单位(Xx菌种厂); d) 接种日期(如:20 X X. X X. X X) ; e) 执行标准。7. 1. 2 包装标签每箱(或其他包装单位菌种应贴有清晰注明以下要素的包装标签:a) 产品名称、品种名称;b) 厂名、厂址、联系电话;c) 出厂日期;d) 保质期、贮存日期、贮存条件;e) 数量;5 GB/T 23599-2009 f) 执行标准。7. 1. 3 包装贮运图示按GB
16、/T191的规定，应注明以下图示标志:a) 小心轻放标志;b) 防水、防潮、防冻标志;c) 防晒、防高温标志;d) 防止倒置标志;e) 防止重压标志。7.2 包装7.2. 1 母种外包装采用木盒或有足够强度的纸盒，内填棉花、碎纸、泡沫塑料等缓冲物。7.2.2 原种、栽培种外包装可采用洁净、干燥的塑料箱、编织袋或有足够强度的纸箱。7.3 运输7.3.1 不得与有毒物品混装、混运。7.3.2 气温在10oC ,. 15 oC和35oC以上时，运输时间不得超过2d;气温在15oC ,. 35 oC时，运输时间不得超过1周:气温在10oC以下时，应保温15oC ,. 35 oC运输。7.3.3 运输中
17、应有防震、防晒、防尘、防雨淋、防冻、防杂菌污染的措施。7.4 贮存7.4.1 母种在使用或销售前，在15oC ,. 20 oC保藏不超过90d。使用前，在20oC ,. 35 oC存放不超过48 h。7.4.2 原种和栽培种菌丝长满种袋(瓶)后，应置于清洁、干燥通风(空气相对湿度30%，.70%)、避光的室内。在28oC ,. 32 oC贮存不超过5d，而在15oC ,._, 20 oC贮存不超过15d。6 GB/T 23599-2009 附录A(规范性附录)草菇母种、原种及栽培种常用培养基及其可选配方A.1 草菇母种常用培养基及其可选配方A. 1. 1 PDA培养基(1000 mL) 马铃薯
18、(去皮)200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000 mL, pH7. 5,., 80 A. 1.2 综合PDA(CPDA)培养基(1000 mL) 马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，磷酸二氢饵2g，硫酸续0.5g，琼脂20g，维生素B120问，水1 000 mL, pH7.58。A.2 草菇原种和栽培种常用培养基及其可选配方A. 2.1 颗粒培养基小麦、谷子、玉米或高粱等粮食颗粒99.5%，生石灰1%，含水量50%士2%, pH8,., 9 o A.2.2 棉籽壳培养基棉籽壳80%，麦款15%，生石灰5%，含水量60%土2%, pH89 o 7 GB/T 23599-2009 附录B(
19、规范性附录)草菇栽培常用培养基柏籽棉培养基柏籽棉95%，用5%生石灰水浸泡，沥去余水后使用。8 GB/T 23599-2009 附录C(规范性附录)菌丝可溶性蛋白电泳方法中PDY培养基配方PDY培养基Difco马铃薯-葡萄糖粉21g，酵母粉2g，蒸馆水1000 mLo 9 GB/T 23599-2009 附录D(规范性附录)草菇菌种ITS序列分析法D.l 检测流程待测样品液体培养基增菌或待测菌株菌丝DNA提取PCR扩增序列测定一如比对分析结果判定。D.2 材料与方法D.2.1 菌体培养待测菌种增菌液体培养基CYM:蛋白豚2g，酵母膏2g，葡萄糖20.2g，硫酸续(MgS04 7HzO) 0.5
20、 g，磷酸氢二何(KzHP04)1g，磷酸二氢饵(KHzP04)1g，纯水1000 mL, pH7. 5,._, 8. 0 0 培养基分装至三角瓶后灭菌，冷却，接种，置于30oC 130 r/min摇床培养3d，菌丝真空抽滤，元菌水洗涤，低温干燥，-20oC保存备用。D.2.2 DNA提取和纯化CTAB(cetyl trimethyl ammonium bromide)法:a) 2倍CTAB提取液在65oC水浴锅中预热。b) 取适量(0.1g_l g)菌丝体置于研钵中，用己灭菌的石英沙或液氮中研磨，同时加入少量聚乙烯基口比咯炕酣(PVP)(防氧化)，将菌丝体充分研磨成粉末状。c) 样品转入1.
21、5 mL离心管中，管内先加入600L2倍CTAB提取液在65oC水浴锅中预热(用少量提取液洗下研钵上残留的粉末样品，轻轻混匀，65oC水浴30min_ 60 min，其间每隔10 min轻轻摇动。d) 冷却2min后，加入等体积约600L)的盼一三氯甲烧-异戊醇(25: 24 : 1)，充分摇动混匀。e) 10 000 r/min，离心10min，取上清液移人另一新管，重复步骤d)用三氯甲;皖-异戊醇(24: 1) 再抽提离心一次。同时将2/3体积的异丙醇(或2倍体积的元水乙醇)预冷。f) 两次抽提后的上清液转人新离心管，加人2/3体积的预冷异丙醇(或2倍体积的预冷元水乙醇)，再加入约1/10
22、体积的乙酸纳(约30L，._，50L)，缓慢翻转混匀，沉淀DNA。g) 13 000 r/min，离心15min，去上清液。70%酒精(400L)漂洗沉淀2次快速翻转振荡几分钟), 8 000 r/min，离心5min，去上清液，沉淀用纸巾吸取剩余乙醇，自然晾干或低温烘干(电风筒吹干)。h) 加1倍TE缓冲液(Tris10 mmol/L十EDTA1mmol/L)溶解(约50L)。一200C保存备用。D. 2. 3 PCR扩增采用真菌核糖体基因间隔区通用引物对ITS1/ITS4(lTS1:TCCGTA GGT GAA CCT GCG G; ITS4:TCC TCC GCT TAT TGA TAT
23、 GC)进行PCR扩增。反应体系:PCRmix25L，DNA模板5L，双蒸水12L，通用引物。ouM)各4L，总体积50L。反应条件:94oC预变性5min; 94 oC 1 min 55 oC 1 min 72 oC 1 min，30个循环;72oC 10 min 完成延伸。D. 2. 4 序列测定PCR扩增产物用1.0%琼脂糖电泳检测，在UVP凝胶成像系统下成像观察条带情况，并保存图像。PCR扩增产物回收纯化后，以PCR引物为测序引物，分别从正反链双向测序，该操作由生物公司完成。10 G/T 23599-2009 D.2.5 序列分析双向序列拼接后在GenBank上进行比对CBlast)，
24、若发现序列与GenBank上已知序列方向相反，则应对序列进行反向互补处理后再比对，对获得的同源序列进行分析，待测菌种与GenBank上某菌种序列同源性达98%以上时，则待测菌与GenBank上该已知菌是同一个种。取草菇V23为草菇的对照标准种，其ITS序列登录号为F379273，其碱基序列如下:GGCTTTCTGGTAGGGTAACCTGCGCAAGGATCATTACAGAATCGAACGCGGGTCGGGCTGATTGCTGGC TCCTCGGAGCAGGTGCACGCCCTCCCCGACGCCTTCCATTCTCCACGTCCCCACCTGTGCACC TTCTGTAGGCCGTGAAGC
25、CGCCTCGTTCGGCTCCCTCGGCTCTACGAGATCTTTTGTACACC CTTGAGAAAAACGTGTTGCAGAGTGTTCTTGTACGACCGGGGACCCCTCGTCGGCCCCATA GACATACCAATACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAG CGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCA CCTTGCGCTCTTTGGCCATTCCGAAGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATCGAATCCTCAAGC CCAGCCCG
26、GCTTCTCCCCGGGCTTTTGGGGGCTTGGAGTTGGGAGCTGTGCGGGTCGCTAGC CTTCGCGATCCGCTCTCCTCAAAGGCATCAGCAGGGCCCAGTCGCAGTCGGCCTCGTGGCGT TGATAGTCCATCTACGCCCCCCCGCGGCCGCACTCAGCGTGGCTCGGCTTCGAACCGTCCGG CCCCTCGAGCCGGACAGGCCGACACACCCCGGCCTCACCCCTTGACACCCTTGACCTCAAATC AGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAGGCGGGAGGAA，当待测菌的IT
27、S序列与草菇V23的ITS序列相似性二三98%时，该待测菌种就是草菇CVolvariellavolvacea)菌种。gON|白山的NH8国华人民共和国家标准草菇菌种GB/T 23599-2009 中苦中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里坷北街16号邮政编码:100045 网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 印张1字数18千字2009年7月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2009年7月第一版当摩定价18.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533书号:155066 1-38068 GB/T 23599-2009 打印H期:2009年10月30日
