1、ICS 07.100.20 C 51 道昌中华人民共和国国家标准GB/T 28228-20门入出境船舶压舱水中单核细胞增生李斯特氏菌的检验方法Detection of Listeria monocytogenes in ballast water of entry-exit ships 2011-12-30发布数码防f;j中华人民共和国国家质量监督检验检亵总局中国国家标准化管理委员会2012-05-01实施发布GB/T 28228-2011 前言本标准按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准修改采用美国食品和药物管理局(FDA)(细菌学检验手册z单核细胞增生李斯特氏菌的检测和计数)
2、(2003年1月)(BAM:Detection and enumeration of Listeria monocytogenes .January 2003)。本标准与FDA方法的主要区别是:一一增加了初筛步骤;一一明确了计数步骤;一一培养箱温度由35c修改为36.C士1.C。本标准由国家质量监督检验检疫总局提出。本标准由中国检验检疫科学研究院归口。本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人:张顺合、王林、庞秋艳、张乐、李金有、李俊成、李德昕、聂维忠、陈春田、顾大勇、慈颖、赵彬、韩辉。I 1 范围入出境船
3、舶压舱水中单核细胞增生李斯特氏菌的检验方法GB/T 28228-2011 本标准规定了人出境船舶压舱水中单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)的检测程序和方法。本标准适用于人出境船舶压舱水中单核细胞增生李斯特氏菌的检测。2 设备和材料2. 1 冰箱:2C8.C。2.2 恒温培养箱:30 .C :l: 1 .C , 36 .C土1.C。2.3 显微镜:10X100X。2.4 元菌移液管或无菌量筒:1mL, 25 mL，精确到0.1mL。2.5 锥形瓶:500mL。2.6 元菌培养皿:直径90mm. 2. 7 元菌试管:16mmX125 mm。2.8 接种环。2.9
4、接种针。2. 10 金黄色葡萄球菌(ATCC25923)。2. 11 马红球菌(Rhodococcusequi)。2. 12 伊氏李斯特氏菌。2. 13 单核细胞增生李斯特氏菌。2. 14 英诺克李斯特氏菌。3 培养基和试剂3. 1 李斯特氏菌缓冲增菌肉汤(BLEB):见A.1.3.2 PALCAM琼脂z见A.2.3.3 ALOA显色培养基1)3.4 含0.6%酵母浸昔的膜酷陈大豆琼脂(TSAye):见A.3.3.5 SIM动力培养基z见A.4。3.6 5%羊血琼脂:见A.5。3. 7 革兰氏染色液。3.8 3%过氧化氢溶液:用于过氧化氢酶试验。3.9 生化反应管2):鼠李糖、木糖、葡萄糖、麦
5、芽糖、甘露醇、MRjVP试验。1) 由法国AES公司提供的产品的商品名，给出这一信息仅为方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可，如果其他产品具有相同效果，则可使用这些等效产品。2) 建议使用商品化的生化反应管以保证质量稳定，也可使用自动微生物生化鉴定仪完成。1 GB/T 28228-2011 3. 10 盐酸口丫睫黄。3. 11 荼睫酣酸锅。3. 12 放线菌酣。3. 13 多粘菌素B。4 检验程序单核细胞增生李斯特氏菌检验程序见图102 30 C士1.Cp，气LCAM琼脂48 h，于4h时加入选择性试剂36.C土1.C鼠李糖、木糖发障试验，同时接种TSAye固1单核细胞增生李斯特氏菌检验
6、程序滤膜，2.C8.C保存备用GB/T 28228-2011 5 操作步骤5. 1 准备用于进行单核细胞增生李斯特氏菌检测的水样应在20C80C条件下进行处理、储存和运输。以无菌操作分别抽滤1L压舱水样两份，取一份集菌滤膜于2oC8 oC保存，以备计数，另一份备检。5.2 增菌以元菌操作取一份集菌滤膜加人到250mL李斯特氏菌缓冲增菌肉汤CBLEB)中，充分振荡混匀。30 oC :f: l oC下培养4h，加入A.1.3中的选择性试剂，继续在300C士1oC培养44h。5.3 分离挑取培养48h的增菌液划线接种于PALCAM琼脂平板和ALOA李斯特氏菌显色琼脂平板，置于360C土1oC培养24
7、h48 h，并观察各个平板上菌落的生长状态。在PALCAM琼脂培养基上，典型菌落呈圆形灰绿色小菌落，周围有一个棕黑色水解环，部分菌落有黑色凹陷;在ALOA李斯特氏菌显色琼脂平板上，典型菌落呈圆形蓝绿色小菌落，周围有不透明晕环。5.4 初筛从以上选择性琼脂平板上挑取5个或以上的典型菌落分别划线接种于膜酷陈大豆琼脂平板(TSAye) , 30 oC士1oC培养24h48 h，以纯化培养;同时分别接种于鼠李糖和木糖发酵管，于36oC :f: 1 oC下培养24h，选择鼠李糖发酵阳性、木糖发酵阴性的纯培养菌落继续进行鉴定。5.5 鉴定5.5. 1 染色镜检李斯特氏菌为革兰氏阳性细短杆状菌F用无菌生理盐
8、水制成菌悬液，在油镜或相差显微镜下观察，可见轻微旋转或翻滚样的运动。镜检可与标准菌株对照观察。5.5.2 生化鉴定挑选典型的纯培养菌落按A.6进行过氧化氢酶试验，选择过氧化氢酶反应阳性的菌落进行其他生化鉴定，包括糖发酵(葡萄糖、麦芽糖、甘露晖)试验、甲基红(MR)试验、VP试验。5.5.3 动力试验挑取典型的纯培养菌落穿刺接种于SIM培养基中，于300C士1oC培养24h48 h，每日观察，李斯特氏菌呈典型伞状生长或月牙状生长。5.5.4 溶血试验将5%羊血琼脂平板底面划分20个25个小格，挑取典型的纯培养菌落剌种血平板，每格刺种一个菌落，并刺种阳性对照菌(伊氏李斯特氏菌和单核细胞增生李斯特氏
9、菌)和阴性对照菌(英诺克李斯特氏菌。穿刺时尽量接近底部，但不要触到底面，防止琼脂破裂，30c士1oC培养24h48 h。在亮光下观察经穿刺的血琼脂平板，单核细胞增生李斯特氏菌在刺种点周围产生微小的透明溶血环，英诺克李斯特氏菌无溶血环，而伊氏李斯特氏菌在接种点周围产生大的透明溶血环。3 GB/T 28228-2011 5.5.5 协同溶血试验CCAMP)在羊血琼脂平板上划两条平行线，分别接种金黄色葡萄球菌和马红球菌。挑取典型的纯培养菌落在两平行线之间垂直划线接种，垂直线与两平行线相近但不相交，于30.C士1.C培养24h48 h，观察培养板上的溶血情况。单核细胞增生李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌
10、接种的区域内溶血反应增强，且通常在24h溶血现象比在48h更明显;而在靠近马红球菌接种的区域溶血反应无增强或增强不明显。5.5.6 鉴定特征单核细胞增生李斯特氏菌的鉴定特征见表1。表1单核细胞增生李斯特氏菌的鉴定特征鼠李糖木糖过氧化氢酶葡萄糖麦芽糖+ + + 十甘露董事MR!VP试验动力试验溶血试验协同溶血试验金葡茵/马红球菌+/+ 十+ +/一注:+阳性;一阴性。5.6 计数5.6.1 如果样品经试验确定单核细胞增生李斯特氏菌阳性，则将另一份集菌滤膜用于计数。5.6.2 以元菌操作取集菌滤膜加人10mL蛋白陈缓冲液，充分洗涤后于20.C士1.C复苏1h，移取0.1 mL涂布ALOA平板，36
11、.C士1C培养24h，计数周围有不透明晕环的圆形蓝绿色小菌落数，平行计数两个平板，取平均值a.5.6.3 每升水样中单核细胞增生李斯特氏菌估算数为100a. 5. 7 结果报告综合以上检测试验结果，报告每升水样中未检出或报出每升水样中单核细胞增生李斯特氏菌估算数。4 A.1 李斯特氏菌缓冲增菌肉汤(BLEB)A. 1. 1 成分膜酷陈大豆粉酵母膏磷酸氢二饵磷酸氢二铀A. 1. 2 制法附录A(规范性附录)培养基和试剂3.0 g 6.0 g 1. 4g 9.6 g 将各组分混合，不加入抗生素，调节pH到7.3土O.2，121C高压灭菌15min。A. 1.3 选择性试剂荼睫酣酸放线菌酣40.0
12、mg/L 50.0 mg/L 盐酸盯睫黄15.0 mg/L GB/T 28228-2011 用元菌水分别制备0.5%(质量浓度)的口丫院黄素溶液和秦晓酣酸溶液，用40%(体积分数)的酒精制备1%质量浓度)的放线菌酣溶液，过滤除菌后。使用时每1000 mL培养基分别加3mL盯脏黄素溶液、8mL荼睫酣酸溶液和5mL放线菌酣溶液。A.2 PALCAM琼脂A. 2.1 成分酵母膏8.0 g 葡萄糖0.5 g 七叶昔0.8 g 拧攘酸铁镀0.5 g 甘露醇10.0 g 酣红0.1 g 氧化铿15.0 g 醋蛋白膜酶消化物10.0 g 心膜酶消化物3.0 g 玉米淀粉1. 0g 肉胃酶消化物5.0 g 氯
13、化铀5.0 g 琼脂15.0 g 蒸馆水1 000 mL 5 G/T 28228-2011 A. 2. 2 PALCAM选择性添加剂多粘菌素B盐酸盯睫黄头抱他院无菌蒸锢水A.2.3 制法5.0 mg 2.5 mg 10.0 mg 500 mL 将A.2.1中成分加热溶解，调pH至7.27. 4 , 121 .C高压灭菌15min，冷却至50.C，加入2mL PALCAM选择性添加剂，混匀后倾倒元菌平皿，备用。A.3 含0.6%酵母浸膏的原酷臆大豆琼脂(四Aye)A.3.1 成分膜陈17.0 g 际陈3.0 g 酵母膏6.0 g 氯化铀5.0 g 磷酸氢二饵2.5 g 葡萄糖2.5 g 琼脂15
14、.0 g 蒸馆水1 000 mL A.3.2 制法将上述各成分加热搅拌溶解，调pH至7.27.4，分装，121.C高压灭菌15min，备用。A.4 SIM动力培养基A. 4.1 成分膜陈多价陈硫酸铁接硫代硫酸铀琼脂蒸馆水A.4.2 制法20.0 g 6.0 g 0.2 g 0.2 g 3.5 g 1000 mL 将上述各成分加热1昆匀，调pH至7.2，分装小试管，121.C高压灭菌15min，备用。A.5 5%羊血琼脂A. 5.1 成分蛋白陈1. 0g 6 牛肉膏氯化铀琼脂蒸锢水A.5.2 制法0.3 g 0.5 g 1. 5g 1000 mL GB/T 28228-20门加热熔化上述各组分，
15、121.C高压灭菌15min，冷却到50.C，以元菌操作加入新鲜脱纤维羊血5 mL，摇匀，倾注平板。A.6 过氧化氢酶试验A. 6.1 试剂3%过氧化氢溶液z现配现用。A.6.2 试验方法用细玻璃棒或一次性接种针挑取单个菌落，置于洁净试管内，滴加3%过氧化氢溶液2mL，观察结果。A.6.3 结果于半分钟内发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。A.7 蛋白陈缓冲渡A. 7.1 成分蛋白陈氯化铀十二水磷酸氢二铀磷酸二氢饵蒸馆水A.7.2 制法10.0 g 5.0 g 9.0 g 1. 5 g 1 000 mL 调节pH至6.7，121.C高压灭菌15min，备用。FFON|NNNH益。华人民共和国
16、家标准入出境船曲压舱水中单核细胞增生李斯特氏菌的检验方法GB/T 28228-2011 国白婪中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号。00045)网址总编室:(010)64275323发行中心:(010)51780235读者服务部:(010)68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 印张O.75 字数15千字2012年3月第一次印刷开本880X12301/16 2012年3月第一版* 书号:155066. 1-44534定价16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68510107GB/T 28228-2011 打印H期:2012年4月16H F002A
