1、ICS 11 .220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 1873一2010日本脑炎病毒抗体间接检测酶联免疫吸附法Indirect ELISA for antibody detection of Japanese encephalitis virus 2010-05-20发布2010-09-01实施命中华人民共和国农业部发布前言本标准的附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位:中国动物卫生与流行病学中心。本标准主要起草人z陈义平。NYjT 1873-2010 I NY/T 1873-2010 日本脑炎病毒抗
2、体间接检测酶联免疫眼附法范围本标准规定了日本脑炎病毒抗体的间接ELlSA检测技术操作程序。本标准适用于迸出口检疫及流行病学调查时对猪血清中日本脑炎病毒抗体的检测。2 间接ELISA2. 1 材料准备2. 1. 1 器材37C恒温培养箱、微量移液器、震荡混匀仪、酶标仪、酶标板等。2 1. 2 包被抗原包被用抗原为日本脑炎病毒囊膜蛋白结构域囚重组蛋白(re-D!)，经大肠杆菌表达后亲和层析纯化而成。每孔包被量为100吨。2. 1. 3 阴性对照血清SPF猪血清，经pH7. 4的磷酸盐缓冲液(附录A)l: 40稀释后作为阴性对照血清。2. 1.4 阳性对照血清日本脑炎病毒疫苗免疫健康猪，抗体中和效价
3、达到1: 640时采血分离血清，将中和效价为1: 640 的阳性血清用pH7.4的磷酸盐缓冲液(附录A)作1: 160稀释，即为阳性对照血清。2. 1.5 包被渡、洗涤液、封闭液、酶标抗体稀释液、底物液、终止液配制方法见附录A2. 1.6 检测前，先将各种试剂材料平衡至室温。2.2 操作方法2.2. 1 抗原包被以pH9. 6的碳酸盐缓冲液稀释抗原(将re-Dill重组抗原稀释至1g/mU，按每孔100L包被酶标板，37C作用2h后，洗涤液(PBST)洗板3次，每次5min。2.2.2封闭每孔加人200L封闭液，37C封闭2h，洗板同上。2.2.3 加待检血清及对照血清以pH7.4的磷酸盐缓冲
4、液作为样本稀释液，将待检血清按1: 40稀释后lOOIL/孔加样，每板同时设置两孔阴性血清对照、两孔阳性血清对照，并设一孔空白对照。37C作用1h，洗板同上。2.2.4 加酶标抗体每孔加入工作浓度的100L兔抗猪酶标抗体，37C作用1h，洗板同上。2.2.5 加底物液每孔加人底物液100L，37C显色作用10min 2.2.6 加终止液每孔加入100L终止液终止反应，15mi且之内测定OD45C值。2.2.7 结果判定在酶标仪上读出ODQ的值。以空白值调零，计算阳性对照00450平均值、阴性对照OD50平均值。NY/T 1873-2010 阴性对照OD450平均值O.2时试验成立。此时，样品。
5、D450值与阳性对照OD450平均值比值二三O.35判为阳性;样品。D50值与阳性对照OD450平均值比值0.35判为阴性。2 A.1 包被液(碳酸盐缓冲液，pH9.6) NaHC3C分析纯)Na,C03 C分析纯)定容至1000mL，混匀oA.2 洗涤液(PBST，pH7. 4) NaCIC分析纯)K日，P04C分析纯)Na2HPO, . 12H，C分析纯)KCIC分析纯)Twecn20C分析纯)硫柳JftC分析纯)加双蒸水至1000mL，调至pH7.40A.3 封闭液(1 %BSA/PBST溶液，pH7.4)附录A(资料性附录)溶液的配制2.98 g 1. 5g 8.0 g 0.2 g 2
6、.9 g 0.2 g 0.5mL 0.1 g BSAC生物技术级)5g.加PBST至500mLA.4 磷酸盐缓冲液(pH7 4) NaCIC分析纯)KH2P，C分析纯)Na2HP04 .12H，OC分析纯)KCIC分析纯)硫柳求(分析纯)加双蒸水至1000mL.调至pH7.40A.5 酶标抗体稀释液8.0 g 0.2 g 2.9 g 0.2 g 0.1 g 将小牛血清lOmL加人到90mL PBST中，混匀。A.6 底物缓冲液(TMB-过氧化氢服溶液)A.6.1 底物缓冲液ATMBC生物技术级)200g.元水乙醇(或DMSO)100mL.加双蒸水至1000mL。NY/T 1873-2010 A. 6. 2 底物缓冲液B(O.1 mol/L拧穰酸-0.2mol/L Na，HPO，缓冲液，pH5.0-5.4)Na2HP04 14.60 g.拧橡酸9.33g.O. 75%过氧化氢尿素6.4mL.加双蒸水至1000 mL.调至pH5. 05. 40 A. 6. 3 将底物缓冲液A和底物缓冲液B按1: 1混合即成底物缓冲液。3 NY/T 1873-2010 A.7 底物液TMB 1 mg, 1%H, 02 25L，底物缓冲液10mL，混合即成。A.8 终止液(2MH, SO,) 将50mL浓H2S04缓慢滴加入300mL蒸馆水中，边加边搅拌，补充蒸馆水至450mL。4
