NY T 1902-2010 饲料中单核细胞增生李斯特氏菌的微生物学检验.pdf
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1、ICS 65.120 B 46 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 1902一2010饲料中单核细胞增生李斯特氏菌的微生物学检验Microbiological examination of Listeria monocytogenes in feeds 2010-07-08发布2010-09-0实施命中华人民共和国农业部发布目q百本标准遵照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由农业部畜牧业司提出。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。NY/T 1902一2010本标准起草单位z中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所t国家饲料质量监督检验中心(北京)J。本标准起草人z饶
2、正华、李丽蓓。I NY/T 1902-2010 饲料中单核细胞增生李斯特氏菌的微生物学检验范围本标准规定了单核细胞增生李斯特氏菌的微生物学检验方法。本标准适用于对饲料中单核细胞增生李斯特氏菌的分离、鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注目期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注目期的引用文件,其最新版本(包括所有的修订单)适用于本文件。GB/T 14699.1饲料采样(lSO6497 , Anirnal feeding stuffs-Sarnpli吨,IDT)3 仪器与设备除微生物实验室常规无菌及培养设备外,其他设备和材料如下3. 1 冰箱。3. 2 恒
3、温培养箱:30oC士IOC、360C土IOC。3. 3 均质器。3. 4 显微镜z目镜10X,物镜10X100X。3. 5 电子天平:感量0.1go 3. 6锥形瓶:100 rnL、500rnL 3. 7 平皿z直径90rnrno 38 试管:16 rnrnX 160 rnrno 3.9 吸管:1 rnL(具0.01rnL刻度)、10rnLC具0.1rnL刻度)。4 培养基和材料除另有规定外,所用试剂均为分析纯,水应符合二级用水的规定。4. 1 增菌肉汤(LB、LB,):见附录A第A.l章。4.2 PALCAM琼脂z见附录A第A.2章。4.3 OXA琼脂见附录A第A.3章。4.4科玛嘉李斯特氏
4、菌显色琼脂。注:由法国科玛嘉公司提供的产品的商品名。给出这信息是为了方便本标准的使用者,并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果,则可使用这些等效的产品。4.5 含0.6%酵母浸膏的膜黯陈大豆琼脂CTSAYE):见附录A第A.4章。4.6 革兰氏染色液.见附录A第A.5章。4.7 SIM动力培养基:见附录A第A.6章。4. 8 羊血琼脂.见附录A第A.7章。4.9含0.6%酵母浸膏的胶赂陈大豆肉汤(TSB-YE):见附录A第A.8章。4. 10 缓冲葡萄糖蛋白陈水(MR和VP试验用):见附录A第A.9章。4. 11 糖发酵培养基z见附录A第A.10章。1 NY/T 1902-20
5、10 4. 12 过氧化氢酶试验:见附录A第A.ll章。4. 13 单核细胞增生李斯特氏菌和阴性对照标准株,如英诺克李斯特氏茵(L口lnocua)和伊氏李斯特氏茵毡.ivanovii)。4. 14 API李斯特氏菌鉴定系统。注:由法国生物梅里埃公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者,并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果,则可使用这些等效的产品。5 采样采样数量和方式按GB/T14699.1执行(采样一仁具必须是灭菌的)。包装为袋、瓶和罐装的样品,应从完整的未开封的包装中采取。团体样品应边取边混和;液态样品应通过振摇混匀。采集的试样密封后,应尽快送到微生物
6、检验室,一般应不超过3h。如果时间过长,可将试样于00C50C中保存。6 试样的制备超过1mm孔径筛的样品需要研磨,研体必须事先灭菌。制备的试样要在密闭瓶中低温保存。饲料试样若不能及时检验,应置于40C冰箱保存,在24h之内检验。7 操作步骤7. 1 增菌以无菌操作称取试样25g(或25mL)加入到含有225mLLB,增菌液的均质容器中,在均质器上连续均质1mn,-._, Z min。于300C士10C培养24h,移取0.1mL,转接于10mL LB,增菌液内,于300C土10C培养18h24 h。7.2分离取u主增菌液分别划线分离于PALCAM琼脂平板、OXA琼脂平板或科玛嘉显色培养基上,于
7、360C士10C培养24h48 h,观察各个平板上生长的菌落。在PALCAM琼脂平板上,单核细胞增生李斯特氏菌典型菌落为小的圆形灰绿色菌落,周围有黑色沉淀形成的晕圈;在OXA平板t.典型菌落呈现浅棕色,在其周围形成黑色晕圈,培养48h后,菌落颜色加深,黑色晕圈的范围扩大。在科玛嘉显色平板上,典型菌落呈规则蓝色菌落并带有白色晕环。7.3 纯化自选择性琼脂平板上分别挑取5个以上可疑菌落,分别在TSA-YE平板上划线纯化,于36(;士rc培养24ho 7.4 鉴定7.4. 1 染色镜检.李斯特氏商为革兰氏阳性短杆菌,用生理盐水制成菌悬液,在泊镜或相差显微镜下观察,该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。7.
8、4.2 动力试验.李斯特氏菌有动力,呈伞状生长或月牙状生长。7. 4. 3 生化鉴定:挑取7.3中纯化的单个可疑菌落,进行过氧化氢酶试验,过氧化氢酶阳性反应的菌落继续进行糖发酵试验和MR-VP试验。单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特征见表10表1单核细胞增生李斯特氏菌生化特征与其他李斯特氏菌的区别菌种溶血反应典型运动葡萄糖麦芽糖L恒l.-VPtt露醇鼠李糖本糖七叶背单核细胞增生李斯特氏商CL. ,阳lWcytogenes)十十十十/+十十2 NY!T 1902-2010 表1(续)商种溶血反应典型运动葡萄糖麦芽糖L但_-VP H露醇鼠李糖木糖七叶昔格氏李斯特民菌+ 十CL. grayi) 十十
9、/+ + 斯氏李斯特民菌十十十CL. seeligeri) 十十/+十+ 威民李斯特氏商CLlelshimeri ) 十十十十/+V 十十伊氏李斯特氏商CL. ivanovii) 十十十十/+十+ 英诺克李斯特氏菌(L. innocua) 十十+ 十/+V 十注j,十阳性;一阴性,V反应不定。注2,六种李斯特民商过氧化氢酶、草兰氏染色、动力试验、也R-VP试验均为阳性。7.4.4 溶血试验:将羊血琼脂平板底面划分为20个25个小格,挑取7.3中纯化的单个可疑菌落刺种到血平板上,每格和j种一个菌落,并刺种阴性对照菌(单核细胞增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌)和阴性对照菌(英诺克李斯特氏菌),穿刺时
10、尽量接近底部,但不要触到底面,同时避免琼脂破裂,360C士IOC培养24h48 h,于明亮处观察。单核细胞增生李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生狭小的透明溶血环,英诺克李斯特氏菌无溶血环,伊氏李斯特氏菌产生大的透明溶血环。7.45协同溶血试验(CAMP),在羊血琼脂平板上平行划线接种金黄色葡萄球菌(Sta户hyloccocusau reus)ATCC 49444和马红球菌(Rhodococcusequi)ATCC 6939,姚取7.3中纯化的单个可疑菌落垂直划线接种于平行线之间,垂直线两端不要触及平行线,于300C土rc培养24h48 h。单核细胞增生李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌的接
11、种端溶血增强,斯氏李斯特氏菌溶血也增强,而伊氏李斯特氏菌在靠近马红球菌的接种端溶血增强。可用API李斯特氏菌鉴定系统代替本试验。7.5 质控实验每次检验均需用标准阳性菌株和阴性菌株进行质量控制。在6试样制备的同时,在一个作为空白对照的LBl增菌液中加入新鲜配制的每毫升含有10个100个单核细胞增生李斯特氏菌的阳性标准菌株培养物稀释液lmL和阴性菌株培养物,按检验程序进行同步检验。8 结果报告如果7.4.17. 4. 5的试验结果符合单核细胞增生李斯特氏菌的特征,报告25g(或25mL)试样中检出单核细胞增生李斯特氏菌。如果不符合,报告25g(或25mL)试样中未检出单核细胞增生李斯特氏菌。9
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