1、ICS 65.120 B 46 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 1902一2010饲料中单核细胞增生李斯特氏菌的微生物学检验Microbiological examination of Listeria monocytogenes in feeds 2010-07-08发布2010-09-0实施命中华人民共和国农业部发布目q百本标准遵照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。本标准由农业部畜牧业司提出。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。NY/T 1902一2010本标准起草单位z中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所t国家饲料质量监督检验中心(北京)J。本标准起草人z饶
2、正华、李丽蓓。I NY/T 1902-2010 饲料中单核细胞增生李斯特氏菌的微生物学检验范围本标准规定了单核细胞增生李斯特氏菌的微生物学检验方法。本标准适用于对饲料中单核细胞增生李斯特氏菌的分离、鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注目期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注目期的引用文件，其最新版本(包括所有的修订单)适用于本文件。GB/T 14699.1饲料采样(lSO6497 , Anirnal feeding stuffs-Sarnpli吨，IDT)3 仪器与设备除微生物实验室常规无菌及培养设备外，其他设备和材料如下3. 1 冰箱。3. 2 恒
3、温培养箱:30oC士IOC、360C土IOC。3. 3 均质器。3. 4 显微镜z目镜10X，物镜10X100X。3. 5 电子天平:感量0.1go 3. 6锥形瓶:100 rnL、500rnL 3. 7 平皿z直径90rnrno 38 试管:16 rnrnX 160 rnrno 3.9 吸管:1 rnL(具0.01rnL刻度)、10rnLC具0.1rnL刻度)。4 培养基和材料除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水应符合二级用水的规定。4. 1 增菌肉汤(LB、LB，):见附录A第A.l章。4.2 PALCAM琼脂z见附录A第A.2章。4.3 OXA琼脂见附录A第A.3章。4.4科玛嘉李斯特氏
4、菌显色琼脂。注:由法国科玛嘉公司提供的产品的商品名。给出这信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。4.5 含0.6%酵母浸膏的膜黯陈大豆琼脂CTSAYE):见附录A第A.4章。4.6 革兰氏染色液.见附录A第A.5章。4.7 SIM动力培养基:见附录A第A.6章。4. 8 羊血琼脂.见附录A第A.7章。4.9含0.6%酵母浸膏的胶赂陈大豆肉汤(TSB-YE):见附录A第A.8章。4. 10 缓冲葡萄糖蛋白陈水(MR和VP试验用):见附录A第A.9章。4. 11 糖发酵培养基z见附录A第A.10章。1 NY/T 1902-20
5、10 4. 12 过氧化氢酶试验:见附录A第A.ll章。4. 13 单核细胞增生李斯特氏菌和阴性对照标准株，如英诺克李斯特氏茵(L口lnocua)和伊氏李斯特氏茵毡.ivanovii)。4. 14 API李斯特氏菌鉴定系统。注:由法国生物梅里埃公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。5 采样采样数量和方式按GB/T14699.1执行(采样一仁具必须是灭菌的)。包装为袋、瓶和罐装的样品，应从完整的未开封的包装中采取。团体样品应边取边混和;液态样品应通过振摇混匀。采集的试样密封后，应尽快送到微生物
6、检验室，一般应不超过3h。如果时间过长，可将试样于00C50C中保存。6 试样的制备超过1mm孔径筛的样品需要研磨，研体必须事先灭菌。制备的试样要在密闭瓶中低温保存。饲料试样若不能及时检验，应置于40C冰箱保存，在24h之内检验。7 操作步骤7. 1 增菌以无菌操作称取试样25g(或25mL)加入到含有225mLLB，增菌液的均质容器中，在均质器上连续均质1mn,-._, Z min。于300C士10C培养24h，移取0.1mL，转接于10mL LB，增菌液内，于300C土10C培养18h24 h。7.2分离取u主增菌液分别划线分离于PALCAM琼脂平板、OXA琼脂平板或科玛嘉显色培养基上，于
7、360C士10C培养24h48 h，观察各个平板上生长的菌落。在PALCAM琼脂平板上，单核细胞增生李斯特氏菌典型菌落为小的圆形灰绿色菌落，周围有黑色沉淀形成的晕圈;在OXA平板t.典型菌落呈现浅棕色，在其周围形成黑色晕圈，培养48h后，菌落颜色加深，黑色晕圈的范围扩大。在科玛嘉显色平板上，典型菌落呈规则蓝色菌落并带有白色晕环。7.3 纯化自选择性琼脂平板上分别挑取5个以上可疑菌落，分别在TSA-YE平板上划线纯化，于36(;士rc培养24ho 7.4 鉴定7.4. 1 染色镜检.李斯特氏商为革兰氏阳性短杆菌，用生理盐水制成菌悬液，在泊镜或相差显微镜下观察，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。7.
8、4.2 动力试验.李斯特氏菌有动力，呈伞状生长或月牙状生长。7. 4. 3 生化鉴定:挑取7.3中纯化的单个可疑菌落，进行过氧化氢酶试验，过氧化氢酶阳性反应的菌落继续进行糖发酵试验和MR-VP试验。单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特征见表10表1单核细胞增生李斯特氏菌生化特征与其他李斯特氏菌的区别菌种溶血反应典型运动葡萄糖麦芽糖L恒l.-VPtt露醇鼠李糖本糖七叶背单核细胞增生李斯特氏商CL. ，阳lWcytogenes)十十十十/+十十2 NY!T 1902-2010 表1(续)商种溶血反应典型运动葡萄糖麦芽糖L但_-VP H露醇鼠李糖木糖七叶昔格氏李斯特民菌+ 十CL. grayi) 十十
9、/+ + 斯氏李斯特民菌十十十CL. seeligeri) 十十/+十+ 威民李斯特氏商CLlelshimeri ) 十十十十/+V 十十伊氏李斯特氏商CL. ivanovii) 十十十十/+十+ 英诺克李斯特氏菌(L. innocua) 十十+ 十/+V 十注j，十阳性;一阴性，V反应不定。注2，六种李斯特民商过氧化氢酶、草兰氏染色、动力试验、也R-VP试验均为阳性。7.4.4 溶血试验:将羊血琼脂平板底面划分为20个25个小格，挑取7.3中纯化的单个可疑菌落刺种到血平板上，每格和j种一个菌落，并刺种阴性对照菌(单核细胞增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌)和阴性对照菌(英诺克李斯特氏菌)，穿刺时
10、尽量接近底部，但不要触到底面，同时避免琼脂破裂，360C士IOC培养24h48 h，于明亮处观察。单核细胞增生李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生狭小的透明溶血环，英诺克李斯特氏菌无溶血环，伊氏李斯特氏菌产生大的透明溶血环。7.45协同溶血试验(CAMP)，在羊血琼脂平板上平行划线接种金黄色葡萄球菌(Sta户hyloccocusau reus)ATCC 49444和马红球菌(Rhodococcusequi)ATCC 6939，姚取7.3中纯化的单个可疑菌落垂直划线接种于平行线之间，垂直线两端不要触及平行线，于300C土rc培养24h48 h。单核细胞增生李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌的接
11、种端溶血增强，斯氏李斯特氏菌溶血也增强，而伊氏李斯特氏菌在靠近马红球菌的接种端溶血增强。可用API李斯特氏菌鉴定系统代替本试验。7.5 质控实验每次检验均需用标准阳性菌株和阴性菌株进行质量控制。在6试样制备的同时，在一个作为空白对照的LBl增菌液中加入新鲜配制的每毫升含有10个100个单核细胞增生李斯特氏菌的阳性标准菌株培养物稀释液lmL和阴性菌株培养物，按检验程序进行同步检验。8 结果报告如果7.4.17. 4. 5的试验结果符合单核细胞增生李斯特氏菌的特征，报告25g(或25mL)试样中检出单核细胞增生李斯特氏菌。如果不符合，报告25g(或25mL)试样中未检出单核细胞增生李斯特氏菌。9
12、小鼠毒力试验若需进步鉴定其致病性，可做小鼠毒力试验(附录B)。3 NY!T 1902-2010 附录A(规范性附录)培养基、试验溶液的自己制和试验方法A.1 李氏增菌肉liii(LB, LB, ) A. 1. 1 成分膜陈5.0 g 多价陈5.0 g 酵母膏5.0 g 氯化铀20.0 g 磷酸二氢饵1.4 g 磷酸氢二锅12.0 g 七叶昔1.0 g 蒸馆水1000 mL A. 1. 2 l!i哥哥将上述成分加热溶解，调pH至7.27. 4.分装，1210C高床灭菌15mn，备用。A. 1.2. 1 李氏I液(LB1)225mL中加入21%茶皖啊酸(用0.05mol/L氢氧化纳溶液配制)0.5
13、 mL 1%丫皖黄(用元菌蒸馆水配制)0.3 mL A. 1. 2. 2李氏E液(LB，)200mL中加入:1%茶睫酣酸。4mL1%叮咬黄0.5mL 经元菌操作分装于适当容器中，每份10mL。A.2 PALCAM琼脂A. 2.1 成分酵母膏8.0 g 葡萄糖0.5 g 七叶昔0.8 g 拧橡酸铁锁O. 5巨甘露醇10.0 g 盼红0.1 g 氯化银15.0 g 路蛋白膜酶消化物10.0 g 心膜酶消化物3.0 g .tt米淀粉1. 0g 肉胃酶消化物5.0 g 氯化锁5.0 g 琼脂15.0 g 4 蒸馆水A.2.2 自己哥哥1000 mL 将上述成分加热溶解，调pH至7.27. 4.分装，1
14、21C高压灭菌15min，备用。A. 2. 2.1 PALCAM选择性添加剂多教菌素B5.0mg 盐酸日丫院黄2.5 mg 头抱他旋10.0 mg 元菌蒸馅水500mL A. 2. 22 配制NY/T 1902-2010 将PALCAM基础培养基溶化后冷却至50C，加入2mL PALCAM选择性添加剂，混匀后倾倒在无菌的平皿中，备用。A.3 牛津琼脂(OXA)A. 3.1 成分蛋白豚23.0 g 淀粉1. 0g 氯化锅5.0 g 拧橡酸铁饺0.5 g 七叶背1.0 g 氯化铿15.0 g 琼脂13.0 g 蒸馅水1000 mL 臼丫院黄素5.0 mg 头抱双硫瞠甲氧2.0mg 放线菌酣400.
15、0 mg 硫酸盐教菌素20.0 mg 磷霉素10.0 mg A. 3. 2 I!i!哥哥除盯院黄素、头抱双硫略甲氧、放线菌酣、硫酸盐教菌素、磷霉素和琼脂外，将其他成分加热煮沸溶解冷却后，调pH至7.07.4，再加入琼脂，121c高ffi灭菌15min，冷却至50C，无菌操作，加入用5mL乙醇和5mL元商水溶解的口丫睫黄素、头子包双硫略甲氧、放线菌酣、硫酸盐毅菌素和磷霉素，摇匀，倾注平板。A4 含0.6%酵母膏膜酶陈大豆琼脂(TSA-YE)A. 4.1 成分膜豚17 g 多价陈3g 酵母膏6g 氯化饷5g 磷酸氢二饵2.5 g 葡萄糖2.5 g 琼脂15 g 5 NY/T 1902-2010 蒸
16、馆水A.4.2 配制1000 mL 将土述各成分加热搅拌溶解，调pH至7.27. 4，分装，121C高压灭菌15min，备用。A.5 草兰氏染色液A.5.1 结晶紫染色液A.5. 1. 1 成分结晶紫95%乙醇1%草酸钱水溶液A.5. 1. 2 配制1.0 g 20.0 mL 80.0 mL 将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸钱溶液混合。A.5.2 草兰氏慎液A. 5. 2.1 成分腆腆化梆蒸馆水A. 5. 2. 2 配制1. 0 g 2.0 g 300.0mL 将腆与腆化主甲先进行混合，加入蒸馆水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馅水至300mLA.5.3 沙黄复染液A 5.31 成分沙
17、黄95%乙醇蒸馆水0.25 g 10.0 mL 90.0 mL A. 5. 32 l!i己制将沙黄辞辛解于乙醇中，然后用蒸馆水稀释。A. 5. 4 染色法A. 5.4.1 将纯培养的单个可疑菌落涂片，在火焰上固定，满加结晶紫染色液，染色1min，水洗。A. 5. 4. 2 滴加革兰氏腆液，作用1min，J./(洗。A.5 4 3 滴加95%乙醇脱色，15s30s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。A. 5. 4. 4 滴加复染液，复染1min，水洗，待干，镜检。A. 5. 5 染色结果革兰氏阴性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。A.6 SIM动力试验A. 6.1 成分膜陈20.0 g 多价陈6
18、.0 g 硫酸铁钱。.2g硫代硫酸钩。.2g 琼脂3.5 g 6 蒸馆水A. 6. 2 配制1000 mL 将上述各成分加热混匀，调pH7.2，分装小试管，121c高压灭菌15min，备用。A. 6. 3 试验方法NY/T 1902-2010 挑取纯培养的单个可疑菌落穿刺接种到USIM培养基中，于30C培养24h48 h，观察结果。A.7 羊血琼脂A. 7.1 成分蛋白陈牛肉膏氯化纳琼脂蒸馆水脱纤维羊血A.7.2 自己制1.0 g 0.3 g 0.5 g 1. 5g 100 mL 5mL10mL 除新鲜脱纤维羊血外，加热溶化上述各组分，121C高压灭菌15min，冷至50C，以无菌操作加入新鲜
19、脱纤维羊血，摇匀，倾注平板。A8 含0.6%酵母漫膏的旗酷陈大豆肉汤(TSB- YE) A. 8.1 成分膜陈17 g 多价陈3g 酵母膏6g 氯化纳5g 磷酸氢二御2.5 g 葡萄糖2.5 g 蒸馆水1000 mL A.8.2 配制将上述各成分加热搅拌榕解，调至p日7.27. 4，分装，121C灭菌15min，备用。A.9 MR-VP试验A. 9.1 缓冲葡萄糖蛋白陈水(MR和VP试验用)A. 9. 1. 1 成分磷酸氢二锦多价陈葡萄糖蒸馆水A. 9. 1. 2自E制5.0 g 7.0 g 5.0 g 1000 mL 溶化后校正pH7.0，分装试管，每管1mL，121C高压灭菌15min,
20、A.9. 1.3 试验方法将可疑菌落接种至此培养基中，36C士1C培养48h , A.9.2 甲基红(MR)试剂7 NY/T 1902-2010 A 9. 2.1 成分甲基红95%乙醇蒸馅水A. 9. 2. 2 自己制10mg 30mL 20mL 甲基红溶于95%乙醇中，然后加入蒸馆水，混匀。A. 9. 2. 3 试验方法培养2d5 d，滴加甲基红试剂一滴，立即观察结果。鲜红色为阳性，黄色为阴性。A 9.3 v-P试验试剂A. 9. 3.1 肌酸溶液A 9 3. 1. 1 成分肌酸单水化合物。.5g 蒸馆水100mL A. 9. 3. 1 2 配制将肌酸羊水化合物溶于水中，备用。A. 9. 3
21、. 2 -蔡酣乙醇溶液A. 9. 3. 2.1 成分荼盼6 g 96%乙醇100mL A. 9. 3. 2.2 配制将茶盼溶于乙醇溶液中。A 9. 3. 3 40%氢氧化锦溶液A.9 3. 3. 1 成分氢氧化饵40 g 蒸馆水100mL A. 9. 3. 3. 2 自己制将氢氧化饵溶于水中。A 9. 3. 4 试验方法培养2d4d后，加入6%荼盼乙醇溶液0.5mL和40%氢氧化御溶液0.2rnL，:!m入2滴肌酸溶液，充分振摇试管，观察结果。阳性反应立刻或于O.5h内出现粉红色至葡萄酒红色;如为阴性，应放在36C土lCT培养4h再进行观察。A.10 糖发酵管A. 10. 1 成分牛肉膏蛋白陈
22、氯化销磷酸氢二饷(Na2HP04 12比0)0.2%澳靡香草盼蓝溶液蒸馆水A. 10.2 自己制8 5.0 g 10.0 g 3.0 g 2.0 g 12.0 rnL 1000 rnL NYjT 1902-2010 A. 10.2. 1 葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按0.5%加入葡萄糖，分装于有一个倒置小管的小试管内，121c高压灭菌15min，备用。A. 10.2.2 其他各种糖发酵管可按上述成分配好后，分装每瓶100mL, 121C高压灭菌15min。另将各种糖类分别配好10%溶液，同时高压灭菌。将5mL糖溶液加人100mL培养基内，以元菌操作分装小试管。A. 10.3 试验方法取适量纯
23、培养物接种于糖发酵管，于36C土lC培养24h48 h，观察结果。蓝色为阴性，黄色为阳性。A. 11 过氧化氢酶试验A. 11. 1 试剂3%过氧化氢溶液:临用时配制。A.1 1. 2 试验方法挑取固体培养基土菌落一接种环，涂抹于元菌玻片或无菌培养皿中，然后滴加3%过氧化氢溶液，观察结果。A. 11.3 结果于半分钟内发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。9 NY/T 1902-2010 附录B(资料性附录)小鼠毒力试验将符合单核细胞增生李斯特氏菌特性的纯培养物接种于TSB-YE肉汤中，于30C土lC培养24h , 4 000 r/min离心5mino弃上清液，用元菌生理盐水制备成浓度为10CFU/mL的菌悬液。取此菌悬液进行小鼠腹腔注射3只5只，每只0.5mL，观察小鼠死亡情况。致病株于2d5 d内死亡。试验时，可用已知菌做对照。单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌对小鼠有致病性。10
