1、5 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 0175-2010 代替SN0175- 1992 进出口食品中弯曲菌的检测方法Detection of Campylobacter Spp. in food for import and export 2010-03-02发布2010-09-16实施淄飞剧创蹦.仿佛飞敏炯防伪，中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局目Ij1=1 本标准代替SN0175-1992(出口食品中弯幽杆菌检验方法机本标准与SN0175-)992相比，主要变化如下:一一修改和规饱了设备和材料气一一增加了蛋及蛋制品等产品的样品制备方法;一一修改及完拌了地陆培养方法;一一
2、增加了红嘴鸥弯曲菌等四种弯曲菌种及亚种的生化图谐;一一增加了API鉴定试验;一一增加了选择性培养基改良CCDA培养基.本标准的附录A为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口.SN/T 0175-2010 本标准起草单位:中华人民共和国湖南出人挠检验检疫局，中华人民共和国中山出入境检验检疫局，中华人民共和回广东出入境检验检疫局，中华人民共和国江苏出入境检验检疫局.本标准主要起1:1人:朱金国、莫瑾、蒋原、伍朝晦、m连飞、朱中武、许龙岩、王志强、祝长青。本标准所代替标准的历次版本发布情况为:-SN 0175- 1992. 迸出口食品中弯曲菌的检测方法1 范围本标准规定了迸出口食品
3、中弯曲菌的检测方法。本标准适用于迸出口食品中弯曲菌的检测。2 规范性引用文件GB 19489 3 设备和材料3.门均质器:4 OOOg8 OOOg。4 培养基和试制4.1 培养基4. 1. 1 olton :l曾菌肉汤:见第A.l章。4. 1.2 0.1%蛋白陈水见A.1.4。4. 1.3 弯曲菌分离培养基:见第A.2章。4. 1.4 改良Skirrow民培养基:见A.2. 2。4. 1. 5 改良CCDA培养基:见A.2. 1。4. 1. 6 哥伦比亚血琼脂平板:见第A.3章。4. 1. 7 用于生化鉴定的改良半团体培养基:见第A.4章。4. 1. 7. 1 中性红。4. 1. 7. 2 甘
4、氨酸。4. 1. 7.3 半眈氨酸-HCl。SN/ T 0175-2010 1)给出这一信息是为了为使本标准的使用者，如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品.SN/ T 0175 2010 4. 1. 7. 4 硝酸伸。4. 1. 8 三糖铁琼脂斜面:见第A.5i量。4. 1. 9 改良-F葡萄糖培养基:见第A.6章。4. 1. 10 半固体储存培养基:见第A.7章。4. 1. 11 冷冻培养基:见第A.8章。4. 2 试剂4. 2. 1 马尿酸盐和布三翻反应试剂:见第A.9章。4. 2.2 茶l应酬酸和头抱菌素flkJ:见第A.l章。4. 2. 3 3%过氧化氢。4. 2.4
5、冻融马羊)血。4. 2.5 氧化酶试剂:见第A.I0章。4. 2.6 在兰氏染色试剂:见第A.11章。4.2. 7 硝酸盐检测试剂A和B.见第A.12章。4. 2. 8 API CAMPY鉴定条。5 检测程序弯曲菌检测程序见图1。哥伦比亚l但平板(微需氧)培养图1弯曲菌检测程序图2 SN/T 0175一20106 样品的运迭和保存在样品的运送及保存过程中不要将样品冷冻，应在4.C士2C温度条件下保存并尽快进行检测，同时注意不便样品干燥.注:弯曲菌在低温下存活时间较长.但是冷冻状态下可能导致该菌的死亡.7 样晶制备7. 1 总则所有样品的制备均应在无菌条件下操作，制样过程应尽快完成。当存在大量其
6、他菌群时，应使用样品的最韧制备液以及1: 10的Bolton增菌肉切稀释液进行增菌培养.7.2 龙虾仁和蟹爪称取50g-100 g放人灭菌袋中，置于具过滤衬套的无菌均质袋中，再添入100mL Bolton增菌肉汤，轻柔振荡5min后，静置5min.取出过法:衬套，滤干内容物，滤液放入培养袋或培养瓶中。若无过滤衬套，也可用灭菌纱布过滤.7.3 净膛畜体或难以分割成25g的样晶适量样品放入无菌均质袋中，加入200mL O. J %蛋白陈水。均质2min-3 min，通过灭菌纱布过滤至250mL的离心瓶中。16OOOg离心15min.井去上清液，用10mL 0.1 %的蛋白陈水悬浮沉淀。l吸取3mL
7、于100mL Bollon增菌肉询中。7.4 液态蛋黄或全蛋混合物将同一批两个样本混合制成混合样，每个样本25g.称取25g混合样品于100mL Bolton增菌肉汤中.轻轻搅拌之后，再移取25mL于另一瓶1mLBolton增菌肉汤中.分别制成两种稀释度的增菌液。7.5 贝类(己去壳)取100g- 200 g样品，放入灭菌搅拌机或其他合适的灭菌容器中混勾.将25g样品由合物放入500 mL 培养瓶中，加入225mL Bolton增菌肉汤，充分氓匀。取?屁匀后被体25mL至另一瓶225mL Bolton增菌肉汤中。lIi成1: 10和1: 100的增菌液。在厌氧罐培养时，培养瓶或培养袋中增菌液的
8、hl应减少到125mL，宜将附菌液分装成两份。7.6水取2L-4 L水样，若样品为添加过次氯酸铁等消毒剂的含氧水样时，应于每1L 7.1样加入5mL 1 mol/L灭菌的硫代硫般俐。根据样品量选择各种直径大小的0，45m无菌憾脱过施样品。过滤后滤膜放入100mL Bolton增菌肉汤中，操作过程中应保持谑膜湿润。7.7 擦拔药签将药签放入装有10mL Bolton增菌肉汤的50mL锥形烧瓶中，折断并奔去接触手棍子部分。重新盖上盖子，不要益紧.将烧瓶放人厌氧罐中。7. 8 牛奶、冷冻乳制品7.8.1 鲜牛奶样品收集时，如果样品pII低于7.6，应用灭菌的碳酸饷(la2C03)搭液调节样品pH到7
9、.2土0.2，并立即送往实验室，再测试pH，调节到7.5士O.2.称取50g样品，20000g离心20min，弃上清液.用10 mL Bolton增菌肉杨溶解沉淀，再吸取至90mL Bolton t曾菌肉汤中.7.8. 2 冰溟淋和其他乳制品冰、祺淋以及其他冷冻乳制品应先融化，称盘时尽可能除去糖块或其他|孟i体成分，同7.8.1步骤。3 SN/T 0175- 2010 7.8. 3 奶酷称取50g放人具过滤衬套的均质袋中，加入50mL 0.1%蛋白陈水，均质瑞8000g-10 OOOg均质30 S.移开过滤衬套，排出陆体5s。将滤液进行离心，如同7.8. 1中鲜牛奶的商心操作.将沉淀溶于Bol
10、ton增菌肉汤中.7.9 其他食品称取25g样品(如果是水果或蔬菜取50g) 虫子具过滤衬套的无菌均质袋中，再添人100mL Bohon增菌肉汤，轻柔振荡5min后，静置5min.取出过滤衬套，泼、干内容物，泌液放入培养袋或增养瓶中。若无过滤衬套.Il用反菌纱布过滤。7. 10 前增茵和增茵7. 10. 1 增茵条件所有增菌过程均应在做需叙条件下进行。7. 10.2 前增菌f 7. 10.2. 1 4 h前增菌对生产或加.时间为10d之内的样品.或为乳制品的样品-4 h. 7.10.2. 2 5h前增菌4泛-_t，.+.1.rtm t，4/th r:J 对冷冻时间超过10d的样品:J-为水祥和
11、贝JJJ.t的lf;b1t_，;使1ll.ih前增幽讼。30.C土1.C培养3 h后转移到:6.C土1C !g 7. 10.3 增茵茵后，再放入42C士1C各琴手.24. ，-h-4&b.贝况也曲菌，制样时可设置篮萃，硝菌温度保持在36-C土1飞.情并5乞啡。8 分离、鉴定及确证a) b) 第二种:弯曲商商落为粘稠、扇平透明、沿接种钱向外扩散、边缘光滑、不规则的透明至半透明或白色菌落。在Skirrow氏平报上生长呈现透明、白色或者棕睛也(可能呈浅红色)突起，边缘不整齐，有时沿接种钱向外扩散的菌落。每个平板选取3个-5个生长典型或疑似菌落制湿片观察.8.2 初步鉴定8.2.1 形态观察对生长典型
12、或疑似菌落涂i显片进行形态观察并重新接种哥伦比亚血琼脂平报微需氧环境下42 c士1oC (胎儿弯曲菌36.C土1.C)培养24.h-仿l飞，进行氧化酶试验、革兰氏染色试验等其他生化试验。可使用暗视野战微镜、相差显微镜进行观察，也可将.j.思片进行结晶紫染色后使用光学显微镜进行现4 SN/T 0175一2010察。弯曲菌的组I1J)f!应为弯曲状、长1.5mm5mm、常连成长短不一的类似锯齿状的链状结柿。大部分刚从平板上接种的菌细胞具有运动性，并且呈螺旋状运动，不过也有将近10%的菌不具有运动性。较老的菌落细胞运动性降低并呈球状。8.2.2 氧化酶试验用俑丝接种奸、选取血平扳上生长的菌落进行氧化
13、酶试验，所有的弯曲菌均应呈现氧化酶阴性结果。注:改良CCDA平板上生长的弯曲国商洛进行氧化酶试验，可能会出现假阴性结柴。8. 2.3 革兰氏染色挑取血平板上的生长菌落进行革兰氏染色，使用0.5%石炭酸品红作为复染剂。弯曲菌为革兰氏染色阴性菌。8. 3 确定鉴定d) 硝酸盐还原试验:培养5d后向培养基中加入硝酸盐民jflJA和B，呈现红色为阳性反应。8.3.3. 4 抗生素抑制试验将己制备的菌液涂布接种哥伦比亚血琼脂平板。并在同一平板中不同位置(分两边)各放置一片分别浸有察院酣酸和先锋霉素榕液的5mm6 mm直径的药纸片。微需氧环坡下36.C士1.C培养24 h-48儿纸片边缘只要未有菌落生段，
14、说明对该抗生素敏感。8.3. 3.5 葡萄糖利用试验挑取菌液穿刺接种含有。-F培养基的小管t卡，接种两管，一管为添加有葡萄糖的培养基，另一管为只有基础成分的路养基。微需氧环境下35.C 37 .C培养4d。弯曲菌不利用葡萄糖或者其他糖，管内应元变化。8.3.3.6 1 %马原酸纳水解试验平板上用接种环挑取较多的菌落置含0.4mL 1%马尿酸饷盐的试管中，注意不要挑取到琼脂。摇SN! T 0175一-2010动?昆匀。37C7.洛2h或37C温箱4h。在液面小心加入0.2mL 7.合苟三酣溶液。不要摇动。37C 水浴或37C温箱10min.观察结果:深紫色为阳性，淡紫色或无颜色变化为阴性。8.
15、3.3.7 API鉴定试验使用API鉴定试验可代替8.3.3.3c)8.3.3. 6试验，进行弯曲菌的检测。9 结果报告9.1 弯曲菌生化鉴别见表L表1弯曲菌属各个种的生化性状2主肠空肠大肠红脐鸥胎儿豚肠乌普萨拉种类弯崩E自弯曲茵弯翩菌弯闹离弯曲菌弯曲菌弯曲菌德莱亚种胎儿亚种25 c生长一土- - + D 35 .C-37 .C生长+ + + + + + + 42 c生长+ 士十+ D + + 硝酸盐还原+ 十十+ + 十3.5%氯化饷H2S试验(乙酸铅试剂条)+ + + 十+ 十十HzS.TSI斜商D +. 过氧化氢酶试验十十+ 十+ + 氧化酶成验+ 十+ 十+ + + 运动惶涂片法+81
16、% ) + + + 十十十1%甘氨酸生长试验+ 十+ + 十+ 十葡萄糖利用试验马尿酸纳水解试验+ + 一抗茶班翻酸就试验Sb S S R R R S 先锋霉素抗性试验R R R R S S S 注十，90%或者更多的菌落呈阳性反应;一，90%或者更多的商落呈阴性反应;D飞1l%-89%菌落呈阳性反应;R，具有抗性，iS，具敏感性.a在新鲜配制的TSI斜丽(3d)上产生少茧的硫化氢.b有报道肠弯曲菌对茶咬丽酸具抵抗性.c有报道胎儿弯曲菌胎儿亚种对先锋霉素具抵抗性句9. 2 通过生化鉴定符合xxx弯曲菌的生理及生化特征的，报告阳性结果.检出xxx弯曲菌/xXg (mL)(针对不同样品取样量)。9
17、. 3 通过生化鉴定不符合XXX弯曲菌的生理及生化特征的，报告阴性结果:未检出xxx弯曲菌/X Xg(mL) (针对不同样品取样量)。10 菌种保存10. 1 如果需要经常使用，可将弯曲菌接种半固体储存培养基中4C保存。长期保存则使用冷冻培养基，一70C储存;也可使用冻干法对菌种进行长期保存。10. 2 半固体储存培养基保存:接种菌株于半固体培养基表面，稍微松开试管盖子，微需氧条件下培养6 SN/T 0 175-2010 24 h后，旋紧盖子，避免光线直接照射，4.C保存。菌株可保存2个月，此后再进行转接。10.3 冷冻培养基保存:将弯曲菌接种子不含抗生素的Skirrow氏培养基上，42.C微
18、需氧中培养24h , 胎儿弯曲菌在37.C培养48h。每个平板倒入1mL冷冻培养基，轻轻刮下菌苔，所得菌悬被转移到灭菌试管，一70.C保存。11 生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应囱具备资格的工作人员检测致病菌，所有培养物应小心处置，并按GB 19489中的有关规定执行。12 废弃物处理和防治污染措施检测过程中的废弃物应经121.C高压灭菌处理至少30min后再弃置。7 SN/T 0175- 2010 附录A(规范性附录)弯曲菌鉴定用试荆、培养基及配制方法A. l Bolton增菌培养基A. 1. 1 基础增菌肉汤培养基及配制A. 1. 1. 1 培养基肉陈水解乳蛋白酵母浸宵氧化呐氯化血
19、红索丙酣酸fl与-丽戊二酸重亚硫酸铀无水碳酸铀蒸恼水A. 1.3.1 头抱菌素铀斗。升，;g5. 0 g 21 .C灭菌15min。待培养基冷却1Ji2i 将0.5g头子包菌素纳充分溶解子灭菌蒸惰水中定容至100mL.使用O.22m的过滤器过滤|涂菌。使用元菌的塑料管或塑料瓶保存，每1L培养基中添加4mL抗生素浴蔽，其终浓度为20mg/L。各种温度条件下的保存期为:a) 4C : 5 d; b) - 20.C :14 d ; c) 一70.C : 5个月。A. 1. 3. 2 甲氧韦氢畸昵乳酸盐100 mL蒸锚水中溶解0.5g甲氧节氨i密院乳酸盐，过滤除菌。4.C保存期为1年。每1L培养基中添
20、加4mL抗生京溶液，其终浓度为20mg/L。或者可使用甲氧韦氨啼吭盐酸盐替代:在O.05 mol/ L HCI中加入0.5g甲氧带氨l将院50.C下搅拌溶解，用蒸馆水定容至100mL.每8 SN/T 0175一-20101 L培养基中添加4mL抗生素榕掖，其终浓度为20mg/ L . A. 1. 3. 3 万古霉素0. 5 g溶解到100mL蒸憧水中过滤除菌.4.C保存期为2个月。每1L培养基中添加4mL抗生素榕椒，其终浓度为20mg/L。A. 1.3. 4 放结茵罔1. 25 g溶解至20时，-30m1，元水乙醇中并加水定容至100mL，过滤除菌。4.C保存期为1年。每1L培养基中添加4mL
21、抗生萦溶液，其终浓度为50mg/L。可用两性每素B代替放线菌酬。脱氧胆酸饷硫酸亚铁丙酣酸制琼脂粉酵母背蒸惚水A. 2. 1. 2 自己制调pH7.4士0.2，121.C高压灭菌20min。冷却培养基后舔加以下抗生萦:a) 头抱菌素饷:称取0.8g溶解至100mL蒸馆水中过撼除菌。每1L琼脂培养基中添加4mL 抗生素溶液，其终浓度为32mg/L。b) 幸IJ福平:称取0.25g缓慢加入到60.0mL-80. 0 mL无水乙醉中，振荫使其充分溶解后蒸馆水定容室100.0mL，一200C保存期为1年。每1L培养基中添加4.0mL抗生索溶辙，其终浓度为10.0mg/L。c) 两性霉素B:称取0.05g
22、溶解至100mL蒸馆水中过淤;除菌;一20.C保存期为1年。每1L培养基冲添加4mL抗生素溶液，其终浓度为2.0mg/L。A. 2. 2 改良Skirrow氏培养基及配制A. 2. 2. 1 培养基及配制蛋白陈15. 0 g 9 SN/T 0175一2010腆蛋白陈酵母浸膏氯化铀琼脂蒸馆*甲氧节氨峪i庭万古霉素多枯菌素B无菌冻融去纤维羊(马)血A.2.2.2 配制2. 5 g 5.0 g 5. 0 g 15. 0 g 1 000. 0 mL 5. 0 mg 10. 0 mg 2 500. O(国际单位70. ) mL 除甲氧节氨l密脏、抗生素和无菌冻融去纤维羊马)血之外，其他成分混合潜解，调p
23、H值至7.4士0.2，将培养基充分摇解。分装至螺口瓶中121.C灭菌20min. I临用前加入除菌的甲氧带氨略览、抗生素和元菌冻融去纤维羊(马)血，括:匀倾注平板备用。A. 3 哥伦比亚血琼脂平板A. 3.1 基本成分动物组织酶消化物淀粉氧化铀琼脂粉蒸饱水A. 3.2 配制23.0 g 1. 0g 5.0 g 16.0 g-18. 0 g 1 000. 0 mL 加热溶解，调pH7.2士0.2，分装，121.C 15 mino培养基冷却1.至50.C左右后，每1000.0 mL基本成分中加入除菌去纤维绵羊血50.0mL，混匀。每平扳倒入15.0mL。在使用前，使平板表面干燥，直至平板表面没有可
24、见的水份为止。平板在室温下可最多保存4h, 在4.C土2.C避光保存期为7d。A. 4 用于生化鉴定的半固体培养基A. 4. 1 基础培养基成分无血和抗生京的弯曲菌增菌肉汤成分(Bolton)琼脂蒸馆水生化试剂:27. 6 g 1, 8 g 1 000. 0 mL a) 中性红溶液(0.2%)，溶解0.2g中性红于10mL乙回事;b ) 硝酸饵(1%)，于无中性红的250mL半固体培养基中加入2.5g; c) 甘氨酸0%)，于含有中性红的250mL半固体培养基中加入2.5g ; d) 氯化制(3.5%)，于含有中性红的250rnL半固体培养基中加入7.5g ; e) 半胧氨酸-HC1(0.02
25、%)，于含有中性红的250mL半固体培养基中加入0.05g. A. 4. 2 配制l煮沸基础培养基，250.0mL分装成4份。3份培养基中加入2.5mL中性红，再加入甘氨酸，氯化倒和半眈氨酸-HCl。没有加入中性红的培养基中加入硝酸啊。每份培养基调节pH为7.4土0.2。分装带螺旋帽的试管，每支10.0rnL. 121 .C高温灭菌20min。10 SN/T 0175-2010 A.5 三糖铁琼脂(TSI)A. 5.1 基础培养基成分蛋白陈20. 0 g 牛肉背5.0 g 乳糖10. 0 g 煎糖10. 0 g 葡萄糖1. 0g 氯化饷5. 0 g 六水合硫酸亚铁锁0. 2 g 硫代硫酸饷0.
26、2 g 琼脂12.0 g 盼红0. 025 g 蒸馆水1 000. 0 mL A. 5. 2 自己制将除琼脂和盼红以外的各成分溶解于蒸tm水中，调pH7.4，加入琼脂，加热煮沸，以洛化琼脂。加入0.2%盼红水溶液12.5mL，播匀。分装试管，装量宜多些，以使得到较高的底层。121C高压灭菌15 min，放置高层斜面备用。A.6 OF葡萄糖利用培养基及配制A. 6.1 培养基蛋白陈氯化饷0.2%澳蹄香酣蓝琼脂磷画室二氢仰诩萄精蒸i留水A. 6. 2 自己和j2. 7 g 5. 0 g 0. 03 g 3 g 0. 3 g 10. 0 g 1 000. 0 mL 以上成分|徐糖外，溶解调pl-I7
27、.0 , 121 C高温灭菌20min后备用。A.7 半固体储存培养基A. 7.1 培养基弯曲菌增菌肉汤(Bolton)琼脂拧核酸饷蒸恪J水A. 7. 2 配制27.6 g 1. 8g 0.1 g 1 000. 0 mL 调节pH为7.4士0.2，煮沸，分装具螺旋帽击管，每支10.0 mL. 121 C灭菌15min，储存过程中，螺旋帽要旋紧，不应添加抗生素和马血。A.8 冷冻培养基灭菌Bolton基础肉汤9. 5 mL 11 SN/T 0175-2010 胎牛血消10%甘氨酸1. 0 mL(O. 22m滤脱过法1. 0 mLCO. 22m洁、膜过滤使用前混合均匀.A.9 马尿酸铀水解试验试剂
28、A. 9.1 1%马原酸铀马尿酸俐燕饱水A.9.2 7)食言行三嗣部三四|司I;I因iJ丁剧A.10 氧化酶试验试剂A. 10.2 1%-蔡醋，乙醇溶液.A.11 1在兰氏染色试3111A. 11. 1 结晶紫染色液纣，晶紫95%乙碎1%草酸锁水潜液将结晶紫溶解子乙醇中，后与A. 11. 2 革兰氏愤液腆且强化仰将tl、黄溶解于乙醇中，用蒸懦水稀释。A. 12 硝酸盐试剂及配制A. 12. 1 试荆试剂A:0.6%二甲基，茶肢。民知IJB:O.8%对氨基苯磺酸。A. 12.2 配制将试剂A和B溶于5mol/L乙酸中。12 1. 0g 100. 0 mL 90. 0 mL 后，加蒸惰7.(至30
29、0.0mL。SN/T 0175- 20 10 参考文献订lS010272- 1 Microbiology of food r.nd animal feed ing stuHs-Horizontal method for detcc tion and enumeration of campylobaler spp. - Part 1 : Detection met hod 2J FDA. Bacteriological Analytical Manual Online Chapter 7: Camyloacler S J 2001. 13 中华人民共和国出人缆检验检疫行业标准进出口食品中弯曲菌的检测方法SNjT 0175- 2010 x. 中国标准出版社出版北京复兴门外三里of:lt街16号邮政编码:100045 网业1:www. spc. net. cn 电话!6852394668517548 中国标准出版社祭监岛印刷厂印刷nu -nu n/-EE-EE-Ed -l|吁，-AU Tl , MN na . 开本880X12301/ 16 印张1.25 字数25千字2010年5月第一版2010年5月第一次印刷印数11 600 份书号:155066 2- 20832
