1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 0184.2一2006食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测方法第2部分:多重PCR方法2006-08-28发布Detection of Listeria monocytogenes in foods -Part 2: Multi-PCR method 061214000324 2007-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局本部分为SN/T0184的第2部分。本部分的附录A为规范性附录。前言本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位:中华人民共和国浙江出入境检验检疫局、浙江大学。本部分主要起草人:程洁、张晓峰、施伟良
2、、方维焕。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。SN/T 0184.2-2006 I SN/T 0184.2-2006 食晶中单核细胞增生李斯特氏菌检测方法第2部分:多重PCR方法1 范围SN / T 0184的本部本部分适用于进出口食品中单核细胞增生李斯特氏2 规范性引用文件协议的各方研究是否可使用部分。GB/ T 6682 SN/ T 1193 3 缩略语3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3. 7 下列缩略语适用于SN/T0184的本部分。PCR polymerase chain 聚合酶链式反应。DNA dNTP dATP 脱氧腺昔三磷酸。dCTP deoxycytidi
3、ne 脱氧胞昔三磷酸。dGTP deoxyguanosine triphosphate 脱氧鸟昔三磷酸。dTTP deoxyuridine triphosphate 脱氧胸昔三磷酸。成为本部分的条款。凡是注日期的引用文均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本SN/T 0184.2-2006 3.8 3.9 3. 10 3. 11 3.12 Taq Thermus aquaticu 水生栖热菌。Triton X-1 00 t-Octylphenoxypolyethoxyethanol 辛基苯氧基聚乙氧乙醇。iap invasion-associate
4、d peotein P60 gene P60蛋白的编码基因。hly ListeriolysinO gene 溶血素基因。EDT A ethylene diaminetetraacetic acid 乙二胶四乙酸。4 防污染措施检测过程中防止交叉污染的措施按照SN/T1193的规定执行。5 设备和材料5.1 PCR 仪。5.2 离心机:4000 r/mino 5.3 高速台式冷冻离心机:12 000 r/mino 5.4 天平:精度0.001g。5.5 冰箱:40C一200C。5.6 恒温培养箱:30oC:J:10C、370C士lOC。5. 7 均质器。5.8 微量可调移液器:1L、10L、10
5、0L、1mL、5mLo 5.9 1. 5 mL离心管。5. 10 电泳仪。5. 11 凝胶成像分析系统。5.12 高压灭菌锅。5.13 制冰机。5.14 单核细胞增生李斯特氏菌标准菌株(54007)。5.15 英诺克李斯特氏菌标准菌株(ATCC 33090)。5.16 腊样芽抱杆菌标准菌株(63301)。6 培养基和试剂6. 1 膜醋陈大豆酵母漫膏肉汤(TSB-YE):见第A.1章。6.2 膜酷陈大豆酵母漫膏琼脂(TSA-YE):见第A.2章。6.3 EB肉汤增菌液(EB):见第A.3章。6.4 PALCAM琼脂:见第A.4章。6.5 OXA琼脂:见第A.5章。6.6 盐酸日丫睫黄溶液Cacr
6、iflavineHCD:见A.3.L6. 7 荼睫嗣酸铀盐溶液(naladixicacid sodium salt):见A.3. 2。6.8 放线菌酣(cycloheximide):见A.3. 4。6.9 TZ裂解液:见第A.6章。6. 10 引物:一一-MonoA:5人CAAACT GCT AAC ACA GCT ACT-3; 一一一LisB:5-TTATAC GCG ACC GAA GCC AA-3勺一-HA1:5-GCA GTT GCA AGC GCT TGG AGT GAA-3; 一一-HA2:5-GCAACG TAT CCT CCA GAG TGA TCG-3。6.11 dNTP:d
7、ATP、dTTP、dCTP、dGTP。6.12 10XPCR缓冲液。6.13 Taq DNA聚合酶。6. 14 琼脂糖:电泳纯。6. 15 澳化乙链。6.16 分子量标记:100 bp2 000 bp DNA marker。6.17 电泳缓冲液:见第A.7章。6.18 加样缓冲液:见第A.8章。6.19 实验用水:按照GB/T6682的规定执行。7 检验步骤7. 1 样晶的收集与处理SN/T 0184.2-2006 如为冷冻样品，应于20C50C解冻，且不超过18h;若不能及时检验，应置于一150C保存。非冷冻的易腐样品应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置于40C冰箱保存，在24h内检验。无
8、菌取样品25g(mL)放入灭菌均质杯或均质袋中加225mL BLEB增菌液，充分均质。7.2 增菌培养与样品均质1昆合的BLEB增菌液(添加了丙酬酸纳)置于300C:l:10C预增菌4h，再加入选择性试剂放线菌酣榕液1.15 mL、日丫院黄溶液0.455mL、荼睫酣酸溶液1.8mL，30oC士10C继续增菌培养。7.3 分离培养7.3. 1 选择性培养基的分离培养分别取300C土10C培养24h和30h增菌液一环，划线分离于选择性培养基OXA、PALCAM琼脂平板上，370C:l:10C培养24h48 h。7.3.2 黑色菌落观察李斯特氏菌在OXA琼脂平板上生长24h后菌落呈现黑色，直径为1m
9、m左右，在其周围形成一个黑色环，培养48h，菌落仍呈黑色，直径2mm3 mm，除在菌落周围有一环外，在菌落中心部位的深层也形成黑点。李斯特氏菌在PALCAM琼脂平板上与在OXA琼脂平板上的菌落相似。在OXA琼脂平板和PALCAM琼脂平板上挑取5个或更多可疑菌落，接种于TSA-YE琼脂平板上，纯培养后进行PCR鉴定。7.4 PCR鉴定7.4. 1 细菌的培养挑取可疑李斯特菌菌落接种于6mL TSB-YE肉汤，370C过夜培养。7.4.2 细菌DNA抽提离心培养液收集细菌(4000r/min, 10 min) ，用1mL灭菌水洗1次后离心(8000r/min ,5 min) ，加入等体积的灭菌水和
10、TZ缓冲液重悬，使细菌浓度约为104cfu/ mL 108 cfu/ mL(肉眼可见明显浑浊), SN/T 0184.2-2006 沸水浴处埋8min，冰水中冷浴10min ,8 000 r/min离心5min，收集上清液即可用于PCR扩增。7.4.3 PCR扩增体系50L反应体系中:10 X PCR buffer 5L、Taq酶(5U/L)1L、MgC12(25mmol/L)3L、dNTP(5 mmol/L)2L、引物MonoA(20mmol/L)和LisB(20mmol/L)各2.5L、HA1(20mmol/L)和HA2(20 mmol/L)各l.5L、模板DNA(5L)，加双蒸水26L。
11、7.4.4 PCR扩增条件95C预变性3min，957.4.5 反应体系对照的(ATCC 33090)提取的DNA作为模板(DNA7.4.5.4 空白对照:用配置反应体系的O. 5g/mL的漠化乙链，物与上样缓冲液混合，分适的电压进行电泳(一般8 结果分析与判定8. 1 结果判断8. 1. 1 若样品PCR扩增产物电泳出现715bp(iap基因带或两者均出现，同时阳性对照扩增乒辄电泳后出8. 1. 2 PCR扩增产物电泳白对照扩增产物电泳后没8. 1. 3 对于可疑阳性样步确认。如确认结果为8.2 结果表述如判定结果为阳性，述为未检出单核细胞增4 A作为模板。和英诺克李斯特氏菌标准菌株450
12、bp( hly基因片段)的任一扩增条和450bp同时出现)，阴性对照现目的片段，阴性对照和空(cAMP)试验等，进行进一定结果为阴性，则结果表附录A(规范性附录)培养基和试剂SN/ T 0184.2-2006 A.1 含0.6%酵母浸膏的膜酷陈大豆肉汤(TSB-YE)A.1 .1 成分膜酷蛋白脏、(或膜蛋白植物蛋白陈氯化制磷酸二氢伺葡萄糖酵母浸膏蒸悟水A.1.2 制法将上述各成分加热煮沸溶A.2 含0.6%酵母浸膏的A. 2.1 成分膜酷蛋白陈(或膜蛋白植物蛋白豚氯化饷酵母漫膏琼脂蒸馆水A. 2. 2 制法除琼脂外，将其他各成备用。A.3 EB肉汤增菌液(EBA. 3.1 盐酸日Y昵黄溶液盐酸
13、口丫昵黄灭菌蒸馆水振摇?昆匀，充分榕解后A. 3.2 荼昵酣酸纳盐溶液O.荼陡酣酸0.05 mol/L氢氧化铀溶液振摇混匀，充分溶解后过滤除菌。A. 3. 3 o. 05 mol/L氢氧化纳溶液氢氧化铀灭菌蒸馆水17.0 g 3.0 g 1 000 mL .3士0.2，分装，1210C灭菌15min，备用。15.5 g 5.0 g 5. 0 g 100 mL 0.1 g 50 mL 琼脂，1210C灭菌15min , 5 SN/T 0184.2-2006 A. 3. 4 肢钱菌嗣溶液1.0%(质量浓度)放线菌自同40%乙醇溶液振摇I昆匀，充分榕解后过滤除菌。A. 3. 5 丙回酸铀溶液10%(
14、质量浓度)丙酣酸饷灭菌蒸馆水振摇泪匀，充分溶解后过滤除菌。A. 3.6 BLEB肉汤增菌液(BLEB)膜酷陈大豆肉汤(TSB-YE)(见第A.1章)丙酬酸铀榕液(见A.3. 5) 1. 0g 100 mL 10 g 100 mL 225 mL 2.5 mL 灭菌后的TSB-YE肉汤，使用前加入丙嗣酸铀溶液，棍合均匀。A. 3. 7 EB肉汤增菌液BLEB肉汤增菌液(见A.3. 6) 盐酸日丫睫黄溶液(见A.3.1) 荼睫酣酸锅盐溶液(见A.3. 2) 225 mL 0.455 mL 1. 8 rriL 放线菌酣溶液(见A.3. 4) 1. 15 mL BLEB预增菌4h后，再加入选择性试剂放线
15、菌酬，盯睫黄、荼睫酣酸。A.4 PALCAM琼脂A. 4.1 成分醋蛋白膜消化物8. 9 g 3号示蛋白陈4.4 g 酵母浸膏4.4 g 牛心膜蛋白酶消化物2.7 g 玉米淀粉O. 9 g 氯化铀4.4 g 甘露醇10.0 g 拧棱酸铁镀0.5 g 七叶昔1. 0g 葡萄糖O. 5 g 氯化惺15.0 g 酣红0.08 g 琼脂15.3 g 蒸锢水1 000 mL 盐酸口丫院黄素0.005 g 硫酸多粘菌素B0.01 g 复达新0.008 g A.4.2 制法除盐酸口丫皖黄素、硫酸多粘菌素B、复达新和琼脂外，将其他各成分加热煮沸溶解冷却后，调pH至7.07.4，再加入琼脂，121.C灭菌15m
16、in，冷却至50.C，无菌操作，加入用适量元菌水溶解的盐酸口丫睫黄素、硫酸多粘菌素B、复达新，摇匀，倾注平板。6 SN/T 0184.2-2006 A.5 OXA琼脂A. 5.1 成分酷蛋白膜消化物8.9 g 3号示蛋白陈4.4 g 酵母漫膏4.4 g 牛心膜蛋白酶消化物2.7 g 淀粉0.9 g 氯化铀4.4 g 拧攘酸铁镀0.5 g 七叶昔1. 0g 氯化惶15.0 g 琼脂15.3 g 蒸馆水1 000 mL 日丫I览黄素0.005 g 头子包双硫唾甲氧0.002 g 放线菌酣0.4 g 硫酸盐粘菌素0.02 g 磷霉素0.01 g A. 5. 2 司司法除日丫睫黄素、头抱双硫瞠甲氧、放
17、线菌酣、磷霉素、硫酸盐粘菌素和琼脂外，将其他成分加热煮沸溶解冷却后，调pH至7.2:l: 0. 2，再加入琼脂，1210C灭菌15min，冷却至500C，无菌操作，加入用5mL乙醇和5mL无菌水溶解的日丫睫黄素、头子包双硫嗖甲氧、放线菌目同、磷霉素，摇匀，倾注平板。A.6 TZ缓冲液4% Triton X-100和5.0mg/mL叠氮化铀(NaN3)溶于pH8.0的Tris-HCl。A.7 电泳缓冲波Tris 54 g，珊酸27.5g , O. 5 mol/L EDTA(pH8. 0)20 mL，加蒸馆水至1000 mL;使用时10倍稀释。A.8 加样缓冲液0.25%澳酣蓝，40%tW，糖。CON-N.守-OH军中华人民共和国出入境检验检疫行业标准食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测方法第2部分:多重PCR方法SN/T 0184. 2 2006 峙中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷峰开本880X 1230 1/16 印张O.75 字数15千字2006年11月第一版2006年11月第一次印刷印数1-2000定价8.00元9导书号:155066 2-17287 SN/T 0184.2-2006
