1、户:才己中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1110- 2002 新城疫病毒分离及鉴定方法Procedure of virus isolation and identification for Newcastle disease 2002- 05-20发布2002 -11-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局SN/T 1110-2002 前本标准等效采用国际兽医局的标准诊断方法和疫苗标准手册)(2000年，第四版)，并参考农业部新城疫检疫技术规范，结合我们的操作经验编写、制定。本标准的附录A、附录B均为标准的附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草
2、单位:中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本标准起草人:单松华、胡永强。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。中华人民共和国出入境检验检疫行业标准范围新城疫病毒分离及鉴定方法Procedure of virus isolation and identification for Newcastle disease 本标准规定了离类新城疫病毒(NDV)分离及鉴定方法。本标准适用于禽类新城疫病毒的分离及鉴定。2 引用标准SN/T 1110-2002 下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修改，使用本标准的各方应探讨使用下列标准
3、最新版本的可能性。国际兽疫局诊断方法和疫苗标准手册)(2000年，第四版)3 材料准备所用试剂均为分析纯。3. 1 普通天平、分析天平、普通离心机、V型血凝板、微型振荡器、50L可调移液器、恒温箱、超净工作台、塑料采血管等。3. 2 抗生素:青霉素、链霉素、庆大霉素和制菌霉素等。3. 3 91l日龄无特定病原体(SPF)鸡胚、1日龄SPF鸡和6周龄SPF鸡。3.4 pH7.0或至pH7.40.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)的配制(见附录A标准的附录)。3. 5 阿氏液(红细胞保存液)的配制(见附录B标准的附录)。3.6 1%鸡红细胞:采集SPF鸡或无新城疫血凝押制抗体的成年鸡血，放入等
4、量的阿氏液中，用20倍体积的PBS洗涤34次，每次以2000 r/min离心(34)min，最后一次5min.用PBS配成1%悬液。4C保存悬液，在72h内使用完。3. 7 拭子准备z将脱脂棉缠于牙签的钝端，使其形成直径。.4cm的脱脂棉球，然后用牛皮纸包扎，每捆10只.121C高压蒸汽灭菌15min.备用。或直接购买商品用拭子。3. 8 标准新城疫病毒、标准阳性血清:由指定单位供应。4 样品采集和制备4.1 样品采集4.1.1 活禽采集气管拭子和泄殖腔拭子(沾有粪便);雏禽采集新鲜粪便。4.1.2 死禽采集口鼻拭子、肺、肾、肠(含内容物)、脾、脑、肝、心等组织，样品可单独采集或者混合，肠内容
5、物常需单独处理。4.1.3 病程长的ND病鸡或非典型ND病例可采集骨髓。4.1.4 将无菌采集的样品装人灭菌的小瓶中，并标记清楚(编号、采样时间)，样品立即送实验室处理或于一30C冷冻保存。中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局2002-05-20批准2002 -1个01实施1 SN/T 1110一20024.2 样品制备4.2.1 取采集样品置于研磨器中磨碎，加入PBS制成10%20%(W/V)的悬液;采集的拭子浸入(23)mLPBS中，充分振荡，反复挤压，弃去拭子。4.2.2 在不超过25C的室温下，1000r/m离心(101日mm。4.2.3 上清液加入抗生素。使用何种抗生素视具体情况而
6、定，常使用的抗生素终浓度为:青霉素(2000 IU/mU，链霉素(2mg/mU，庆大霉素(50吨/mU和制菌霉素(lOOOIU/mg);粪便和泄殖腔拭子样品，抗生素量提高5倍。加入抗生素后用0.2mol/L磷酸氢二铀(见附录A1.1)调节pH至7.07. 4。4C作用4h或过夜，或室温作用(12)h，或3TC作用30min，以确保无菌。或上清液经0.45m滤膜过滤除菌。或上清液5000r/m离心10min后，移出上清液，再8000 r/m离心10min，取上清液进行下一项试验。4.2.4 上述除菌液应尽快进行试验。如没有条件，可在一30C冷冻保存。5 操作方法5.1 病毒分离培养5. 1. 1
7、 细菌污染检查将上述除菌液接种于灭菌的普通营养琼脂平板上，37C培养24h，检查有无细菌生长。当有细菌生长时，应按4.2.3法，进一步作无菌处理。5.1.2 鸡胚接种用1mL注射器吸取上述除菌液，经尿囊腔接种至少5枚911日龄SPF鸡胚，每胚0.2mL，置于(3537) C孵育47d。5.1.3 培养物的收集及检测弃去24h内死亡的鸡胚。收集24h以后死亡的和频死的以及孵化结束时存活的鸡胚，置4C冰箱(424)h ，收集其尿囊液。用血凝试验检测尿囊液的血凝(HA)活性，采用固定抗体稀释病毒法，方法参见SN/T1109 20020 HA阴性者至少用911日龄SPF鸡胚再传代一次。5.2 病毒鉴定
8、HA阳性的尿囊液必须用新城疫病毒阳性血清进行血凝抑制(HI)试验，以确定NDV的存在，方法见SN/T1109-2002。5. 3 毒力测定评价NDV分离株的致病性强弱，可采用以下方法中的一个或几个进行。5.3.1 鸡胚平均致死时间(MDT)5.3.1.1 将新鲜的感染尿囊液，用灭菌生理盐水连续10倍递增稀释成10-610-9四个不同稀释度。5. 3. 1. 2 每个稀释度分别经尿囊腔接种5只910日龄SPF鸡胚，每只0.1mL，置于3TC培养。5. 3. 1. 3 剩余的病毒稀释液置于4C8h后，每个稀释度分别接种另外5只SPF鸡胚，每只0.1mL，置于3TC培养。5.3.1.4 每日照蛋两次
9、，间隔12h，共观察7d，记录每只鸡胚的死亡时间。5.3.1.5 确定最小致死量(MLD)(引起所有鸡胚死亡的病毒的最高稀释度)。5.3.1.6 MDT(最小致死量引起鸡胚死亡的平均时间)确定见式(1)。-十一Y一一y N-T + X一一z-N-T D M . ( 1 ) 式中:T死亡总胚总数;Nx-x小时死亡胚数;2 SN/T 1110 - 2002 Ny-Y小时死亡胚数;XCY)发生鸡胚死亡的小时数。5.3.2 脑内致病指数CICPD5.3.2.1 取HA滴度24以上的新鲜的感染尿囊液，用无菌生理盐水(不加添加剂如抗生素等)稀释10 倍。5. 3. 2. 2 脑内接种出壳(2440)h之间
10、的SPF雏鸡，共接种10只，每只接种0.05mL。5.3.2.3 设立生理盐水和标准毒株阳性对照。5.3.2.4 接种鸡隔离饲养，每24h观察一次，共观察8d。每次观察应做好记录，正常鸡记作0，病鸡记作1，死鸡记作2，(鸡死亡后在每次观察中仍记2)。5.3.2.5 ICPI(每只鸡8天内所有观察计分总数的平均数)确定见式(2)。式中:T-8天累计观察鸡的总数;2:5一-8天累计发病数;2:d一-8天累计死亡数。5. 3. 3 静脉致病指数CIVPD1X2:5十2X 2-d ICPI =一一T5.3.3.1 取HA滴度高于24的新鲜感染尿囊液，用灭菌生理盐水稀释10倍。5.3. 3. 2 翅静脉
11、接种6周龄的SPF鸡:接种10只，每只0.1mL。5.3. 3. 3 设立生理盐水和标准毒株阳性对照。. ( 2 ) 5.3. 3. 4 隔离饲养，每24h观察1次，共10天。每次观察要记分，正常鸡记作0，病鸡记作1，瘫痪鸡或出现其他神经症状记作2，死鸡记作3(每只死鸡在其死后的每次观察中仍记作3)。5. 3. 3. 5 IVPI(10天内每次观察每只鸡的记录总数的平均数)确定见式(3)。IVPI = 1Zs+27户+3X到式中:T-10天累计观察鸡总数;:2:5-10天累计发病数;Z户一-10天累计瘫痪数;三d一-10天累计死亡数。5.3.4 结果判定. ( 3 ) 5.3.4.1 MDT低
12、于或等于60h死亡为强毒力型，MDT在(6090)h之间死亡为中等毒力型，MDT大于90h死亡为低毒力型。5. 3. 4. 2 ICPI值越大，NDV致病性越强，最强毒力病毒的ICPI接近2.0，而弱毒株的ICPI值为0。在使用弱毒疫苗的国家，分离株的ICPI值在O.7以上，可认为强毒力病毒感染。5. 3. 4. 3 IVPI值越大，NDV致病性越强，最强毒力病毒的IVPI值可达3.0，弱毒株的IVPI值为0。3 SN/T 1110 - 2002 附录A(标准的附录)磷酸盐缓冲液的配制A1 pH7.0或至pH7.4 Q. 01 mol/L磷酸盐缓冲液CPBS)的配制。Al1 0.2 mol/L
13、磷酸氢二饷和0.2mol/L磷酸二氢铀的配制(见表A1)。表Al- 0.2 mol/L磷酸氢二纳0.2 mol/L磷酸二氢纳磷酸氢二纳(2日20)磷酸氢二纳Cl2H2)磷酸二氢饷CH2)磷酸二氢铀(2H，)35. 61 g 71. 64 g 27.6 g 31. 21 g 水1 000 mL 水1 000 mL 水1000 mL 水1 000 mL 注:121 C高压蒸汽灭茵15min -_ A1.2 0.2 mol/L磷酸缓冲液CPB)的配制(100mL) (见表A2)。表A2pH 0.2 mol/L磷酸氢二纳，mL0.2 mol/L磷酸二氢锅，mL7.0 61. 0 39. 0 7.2 7
14、2.0 28.0 7.4 81. 0 19.0 按所需pH值查表，按体积比例混合二液，即为0.2mol/L PB储存液。A 1.3 0.85%氯化铀的配制氯化铀8.5g加蒸锢水至1000 mL。A1.4 pH7.0或至pH7.4 O. 01 mol/L PBS的配制4 以0.85%氯化铀溶液将储存液稀释20倍即得工作液。121 C高压蒸汽灭菌15min，置室温或4C保存。B1 阿氏灌(红细胞保存液)葡萄糖2.05 g 拧攘酸铀C2H20)0.80 g 氧化铀0.42 g SN/T 1110 - 2002 附录B(标准的附录)阿氏液的配制蒸馆水加至100mL 溶解后，以10%拧攘酸调节pH至6.1，过滤，分装，10磅10min灭菌，40C保存。F d NOON-OFFF 同Z中华人民共和国出入境检验检疫行业标准新城症病毒分离及鉴定方法l矶、SN/T 1110-2002 中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷当&导印张3/4字数11千字2002年9月第一次印刷开本880X12301/16 2002年9月第一版印数1-20007G 4唔定价8.00网址书号:155066 2-14713 版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533SN/T 1110-2002
