1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1526-2005 马巴贝斯虫病检测方法微量补体结合试验方法Determination of babesia equi-Micro-complement fixation 2005-02-17发布2005-07-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局前本标准的附录C、附录D是规范性附录，附录A、附录B是资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准由中华人民共和国天津出入境检验检疫局起草。本标准主要起草人z王玉玲、侯艳梅、赵样平、杨金良。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。SN/T 1526-2005 I 1 范
2、围马巴贝斯虫病检测方法微量补体结合试验方法本标准规定了马巴贝斯虫病微量补体结合试验的操作技术要求。本标准适用于马属动物马巴斯虫病的血清学诊断。2 规范性引用文件SN/T 1526-2005 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682 分析实验室用规格和试验方法3 试剂和材料3.1 试剂3. 1. 1 试验用蒸馆水为GB/T6682中的三级水。3.1.2 稀释液:生理盐
3、水。3. 1. 3 补体结合抗原:按说明书使用，使用前充分摇匀。3. 1. 4 标准阳性血清:使用前用蒸锢水榕解至规定容积。3. 1.5 标准阴性血清:使用前用蒸锢水溶解至规定容积。3. 1.6 榕血素:使用前用蒸锢水溶解至规定容积。3. 1. 7 补体:使用前用蒸情水溶解至规定容积。3. 1. 8 绵羊全血:选健康成年绵羊，无菌颈脉采血.1.2份阿氏液加1份血，混匀.40C冰箱内保存5d后备用。3.2 材料3.2. 1 玻璃试管:10 mmX 75 mm.圆底，洁净。3.2.2 试管架。3.2.3 微量移液器。3.2.4 可调连续加样器。3.2.5 96孔U型微量板。3.2.6 96孔平底C
4、U)微量板。3.2.7 ELISA读板仪。3.2.8 水平转子离心机。3.3 被检血精3.3. 1 采血和分离按常规方法采血和分离血清。血清必须新鲜，无蛋白絮凝物，无榕血，无腐败气味。SN/T 1526-2005 3.3.2 运送和保存防止血清受热，若3d内不能送到实验室，需用冷藏方法运送血清。血清应放至4.C冰箱内保存。4 操作方法4. 1 预备试验4. 1. 1 3%红细胞悬浮液的制备4. 1. 1. 1 绵羊全血充分混匀后，取所需量用稀释液洗三次，每次水平转子离心机2000 r/ min离心5 min.最后一次离心10min. 4. 1. 1.2 取1份下沉血泥加入到24份稀释液中，充分
5、混匀，制成红细胞悬浮液。4. 1. 1.3 取出250L红细胞悬浮液加入到4.75mL蒸馆水中，使红细胞充分破解(液体清亮)。4. 1. 1.4 取100L加入到平底微量板孔内，平行加8个孔。4. 1. 1.5 用ELlSA读板仪540nm下读OD值，算出平均OD值，代人校正红细胞浓度见式(1):式中zG一一稀释液加入量Fb一一平均OD值;c一一红细胞悬浮液量。bXc a = -=-:-:-:= - C 0.115 4.1. 1. 6 取校正红细胞浓度时所需的稀释液量加入到红细胞悬浮液中即得3%红细胞悬浮液。4. 1.2 溶血素效价的测定4. 1.2. 1 稀释溶血素. ( 1 ) 取0.2m
6、L溶血素原液，加入到19.8mL生理盐水中，制成1: 100稀释的溶血素，再按表1稀释成不同稀释倍数的榕血素。表1洁血素的稀释稀释倍数溶血素量/mL生理盐水/mL1 I 500 1 I 100溶血素1.04.0 1: 1 000 1 : 100溶血素2.018.0 1 : 1 500 1 : 100溶血素0.57.0 1 : 2 000 1 : 100溶血素0.59.5 1 : 3 000 1 : 1 000溶血素1.02.0 1 : 5 000 1 I 1 000溶血素1.04.0 1 : 10 000 1 : 1 000溶血素1.09.0 注:如果溶血素是由等量甘油保存，则溶血素原液所需量
7、加倍，并相应减少生理盐水量。4. 1.2.2 制备不同稀释倍数的溶血景致敏红细胞取7个试管，每管加l.5 mL 3%的红细胞悬浮液，然后分别缓慢加入不同稀释倍数的榕血素l. 5 mL.混匀.37C水浴箱中感作15min。SN/T 1526一20054. 1.2.3 溶血素效价的确定将补体原液预稀释至1: 150，按表2进行测定。表2溶血素效价测定试管号l 2 3 4 5 6 7 稀释液/mL1. 0 1. 0 1. 0 1. 0 1. 0 1. 0 1. 0 1/150补体/mL0.5 O. 5 0.5 0.5 0.5 0.5 O. 5 不同稀释液倍数致敏红细胞/mLO. 5 0.5 O. 5
8、 O. 5 0.5 O. 5 O. 5 溶血素稀释倍数500X 1 OOOX 1 500x 2 OOox 3 OOox 5 OOox 10 OOox 感作37C水浴30min(每间隔5min振1次)冷稀释液/mL2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 将各管用水平转子离心机2000 r/ min离心3min，取上清液100L分注平底微量板，540nm下读OD值。按OD值X100/0.115算出各管溶血度，在普通坐标纸上以溶血素的稀释度为横坐标，溶血度为纵坐标，绘制曲线，确定出现平高线的点，比此浓度高25%的稀释度定为溶血素的工作效价(即为1. 25倍，榕血素稀释倍数X80%=溶
9、血素工作效价)(参见附录A)。4.1.3 制备敢敏红细胞悬浮液按测定的潜血素效价稀释溶血素，缓慢加入到等量的3%绵羊红细胞悬浮液中，?I昆合均匀，置370C水浴箱中感作15min。4. 1. 4 补体效价的测定补体预稀释至1/150，做2组重复管，按表3进行测定。表3补体效价测定试管号1 2 3 4 5 6 1/150补体/mL0.3 0.4 O. 5 O. 6 O. 7 O. 8 稀释液/mL1. 2 1. 1 1. 0 O. 9 0.8 O. 7 第一次感作37C水浴30min 致敏红细胞0.5 O. 5 0.5 O. 5 0.5 O. 5 第二次感作37C水浴30min(每间隔5min振
10、1次)冷稀释液/mL2.0 2. 0 2. 0 2.0 2.0 2.0 将各管用水平转子离心机2000r/min离心3min，取上清液，540nm下读OD值，按平均OD值100/0. 115计算出各管的榕血度(Y)，在双对数坐标纸上以Y/000-Y)为横坐标，补体用量为纵坐标，制成一直线，找出50%搭血时补体的用量(含1个CH50单位)，代入公式:补体稀择倍数/10X50%溶血时补体用量，即得出本试验补体工作效价(含2.5个CH50单位)(参见附录B)。4.1.5 抗原效价的测定4. 1. 5. 1 标准阳性血清和标准阴性血清分别用稀释液作1/5稀释，置620CJj(浴箱中灭活30min。4.
11、 1. 5. 2 然后将标准阳性血清作倍比稀释(见附录。4. 1.5.3 将抗原从1/4作倍比稀释(见附录C)。4. 1.5.4 建立方阵试验，在U型微量反应板中进行。试验程序:25L血清+25L抗原+25L补体370C振荡感作40min十25L致敏红细胞370C振荡感作30min，同时设立血清对照、抗原对照、补体对照(见附录。4. 1.5.5 记录测定结果。取出微量反应板，水平转子离心机2000 r/min离心3min，与标准比色孔(比色孔的配制见附录D)比较，观察榕血度，记录结果。3 SN/T 1526-2005 4.1.5.6 确定抗原效价。在对照成立时，与阳性血清各稀择度发生抑制恪血最
12、强的抗原最高稀释度为抗原效价，即为1个单位抗原，本试验抗原使用2个单位。4.2 正式试验4.2.1 溶血素、抗原、补体按预试验测定的工作效价稀释。4.2.2 被检血清和标准强阳性血清、弱阳阳，性血清、阴性血清作1/月5稀释，置6臼20C7.水k浴箱内灭活3omi归n4.2.3 将灭活后的标准强阳性血清、弱阳阳，性血清和阴性血清在U微量反应板中进行倍比稀释。一般标准强阳性血清做故六个稀释度，弱阳性血清和阴性血清可做三个稀蒋度。4.2.4 25L血清十25L抗原十25L补体370C振荡感作40min+25L致敏红细胞370C振荡感作30min，同时建立标准强阳性血清对照、弱阳性血清对照、阴性对照、
13、抗原对照、补体对照和红细胞对照(见表的。表4血清效价的测定血清抗补体对照血清试验孔补体抗原2.5个1. 25个0.625个红细胞项目对照对照补体补体补体1/5 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/5 单位单位单位血清/L25 25 25 25 25 25 25 抗原/L25 25 25 25 25 25 25 稀释液/L25 25 50 50 50 补体/L25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 第一次感作37C振荡40min 致敏红细胞/L25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 第二次感作37C振荡30min 4.2.5
14、 取出微量反应板，水平转子离心机2000 r/min离心3min，比照标准比色孔，记录结果。5 判定5. 1 被检血清效价的确定比照标准比色孔判读，达到50%抑制溶血时血清的最高稀释度为该血清的效价。5.2 结果判定各对照的结果成立时，可进行判定。否则，补体的效价应重新测定，并重新做4.2试验。5.2. 1 标准阳性血清对照:标准阳性血清效价与己知效价或预测效价变化范围不超过一个滴度。5.2.2 阴性血清对照:100%溶血。对照75 25 5.2.3 血清抗补体对照:抗补体对照孔100%洛血(如果抗补体对照孔与试验孔的抑制榕血程度相同说明该血清为抗补体)。5.2.4 抗原对照:100%梅血。5
15、.2.5 补体对照:2.5个单位补体对照:100%洛血。1. 25个单位补体对照:部分榕血。O. 625个单位补体对照:不榕血。5.2.6 红细胞对照:不熔血。5.2.7 阳性判定:一般被检血清稀释1/5以上达到50%抑制溶血时判为阳性。5.2.8 阴性判定:一般被检血清稀释1/5小于50%抑制榕血时判为阴性。4 SN/T 1526-2005 附录A(资料性附录)溶血素效价的确定80 nununununu 76543 20 10000X 5000X3000X2 OOOX 1500X 1 OOOX 500X 固.1溶血素效价的确定附录B(资料性附录)补体效价的确定O. 3 O. 7 0.6 O.
16、 5 0.4 0.2 0.1 O. 1 O. 15 0.2 0.3 0.4 0.50.6 0.8 1 0.70.9 1. 5 2 3 4 5 6 78910 圄B.1补体效价的确定5 SN/T 1526-2005 项目1/4 1/8 抗原/L25 25 1/5 25 25 1/10 25 25 1/20 25 25 阳性血清/L1/40 25 25 1/80 25 25 1/160 25 25 1/5阴性血清/L25 25 补体工作效价/L25 25 稀释液/L第一次感作致敏红细胞/L25 25 第二次感作附录C(规范性附录)抗原效价测定表表C.1 方阵试验抗原稀释度1/16 1/32 1/6
17、4 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 1/128 1/256 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 37C振荡40min 25 25 25 25 25 37C振荡30min 血清抗原补体红细胞对照对照对照对照25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 50 75 25 25 25 25 注:抗原对照为100%溶血，补体对照为100%溶血，红细胞对照为不溶血，血清对照
18、为100%溶血时，试验成立。6 D.1 制备血红素附录D(规范性附录)标准比色孔的配制D. 1. 1 取3%绵羊红细胞1.5 mL.加入到10.5mL蒸锢水中，充分破解。D. 1.2 加入4.25%氯化铀3.0mL。D.2 制备0.3%绵羊红细胞取3%绵羊红细胞1.5 mL.加入到13.5mL稀释液中。D.3 标准比色管的配制按表D.1进行配制。试验管溶血度/C.%) 血红素/mL 0.3.%绵羊红细胞/mLD.4 标准比色孔的配制1 2 。10 。0.2 2.0 1. 8 表D.1标准比色臂的配制3 4 5 6 20 30 40 50 0.4 0.6 0.8 1. 0 1. 6 1. 4 1
19、. 2 1. 0 取0%100%榕血度洛液各100L.分注相应的微量孔内。7 60 1. 2 0.8 SN/T 1526-2005 8 9 10 11 70 80 90 100 1. 4 1. 6 1. 8 2.0 0.6 0.4 0.2 。mCON-NmFHZm 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准马巴贝斯虫病检测方法微量补体结合试验方法SN/T 1526-2005 * 中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷4峰印张O.75 字数15千字2005年5月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2005年5月第一版晤定价8.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533书号:155066.2-16217
