1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1612-2005 香石竹环斑病毒血清学检测方法Serological detection method of carnation ringspot dianthovirus 2005-08田18发布060608000121 2006心2-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检夜总局别高本标准出国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本标准主要起草人:陶庭典、易建平、印丽萍、杨翠云、戚龙君、朱伟组。本栋准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。SN/T 1612-2005 I 香石竹环斑病毒血清学
2、检测方法1 范围本标准规定了香石竹环斑病毒的DAS-ELISA检测方法。本标准适用于香石竹种苗以及其他进境植物种苗中香石竹环斑病毒的检测。2 缩畸语下列缩略i吾适用于本标准。DAS-ELISA:双抗体夹心ELISADouble antibody sandwich ELISA o PBS:磷酸盐缓冲液Phosphate Buffer Saline o 10XPBS: 10倍浓度的PBS母液。PBST:含Tween-20的PBS。SEB:样品抽提缓冲液Sample Extraction Buffer。CB:包被缓冲液Coating Buffer。3 病毒概述3. 1 病毒学名Carnation r
3、ingspot virus，缩写:CRSV。3.2 病毒粒体等轴对称二十面体，直径约34nmo 3.3 病毒分类SN/T 1612-2005 属于番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)、香石竹环斑病毒属(Dianthovirus)是Dianthovirus属的典型成员。3.4 病毒稳定性体外存活期:20oC下50d60 d;稀释限点1。一5;致死混度:80oC(10min)。3.5 自然寄主主要自然侵染香石竹，德国从苹果、梨等果树上分离到该病毒。3.6 分布主要发生在中亚、欧亚以及北美地区。印度、澳大利亚也有发生。3. 7 传播主要通过种苗进行远距离传播。3.8 血清学特性病毒具有极强的
4、免疫原性，微量沉淀法测得的抗体效价超过1/4000。多种血清学方法均对该病毒有好的检测效果。4 仪器或器具4.1 酶联板。4.2 可调式移被器(2.5L、10L、100L、200L、1000L各一支)及相应吸头。4.3 12孔道200L可调式移液器及吸头。4.4 酸度计。SN/T 1612-2005 4.5 调温水浴锅或调温培养箱。4.6 ELISA洗板机(可选)。4. 7 酶标仪。4.8 样品榨汁设备(微量样品榨汁机或者研钵等)。4.9 量筒(10mL、20rnL、50rnL、100rnL、500mL、1000 rnL各一个)。4.10 分析天平精度1/10 000 go 4. 11 试剂瓶
5、口ornL、50rnL、100rnL、500rnL、1000 mL各两个)。4.12 封口膜Parafilrno4.13 吸水纸。5 试剂、溶液及生物制荆本标准中所有化学试剂的纯度除特别说明外均为分析纯。实验用水至少是蒸铺水。5.1 10XPBS磷酸盐缓冲i夜氧化铀(NaCl)氯化押(KCD磷酸二氢锦(KHzP04) 磷酸氢二铀CNazHP04.2HzO) 加水定容至1L。5.2 PBS磷酸盐缓冲液10XPBS 水调节pH至7.4后再用水定容至1L。5.3 PBST洗板缓冲液81. 8 g 1. 49 g 2.72 g 14.2 g 100 mL 850 rnL 在PBS中加入Tween-20
6、.使丁ween-20的浓度为0.1%(体积比)。5.4 SEB样品抽提缓冲液在PBS中加入以下试剂配制SEBPVP(放度为2%，PVP即聚乙烯毗咯:境酣)卵清蛋白(浓度为0.2%)Tween也20(终浓度为0.05%) NaN3 (使其终浓度为0.05%)。5.5 CB包被缓冲溜联酸铀(NaZC03) 碳酸氨铀(Na丑C03)叠氮化纳(NaN3) 7( (Hz ) 调节pH至9.6后再用水定容至1L。5.6 ELISA底物5.6. 1 底物援;中渣1. 59 g 2.94 g 0.50 g 900 mL 用水将二乙喜事胶配制成10%浓度(体积比)，pH值无须调整。5.6.2 底物用10%二乙醇
7、按溶液将对硝基苯磷酸配制成1rng/rnL的浓度(现配现用)。5. 7 抗体IgG纯化的香石竹环斑病毒抗体IgG，使用周内外正式注册的商品根据供应商的说明用包被缓冲液稀2 释为工作浓度。5.8 酶栋抗体SNjT 1612-2005 碱性磷酸酶标i己的香石竹环斑病毒抗体，使用国内外正式注册的商品，用SEB稀释为工作战度。6 样品制备6. 1 阳性对照样品香石竹环斑病毒的纯病毒或者已知含病毒的植物组织，出抗血清供应商提供，根据供应离的说明将阳性对照样品用SEB制备成恰当的浓度。6.2 阴性对照样品由抗血清供应商提供，用SEB制备。6.3 空白对照SEB作空白对照。6.4 待测样品的制备将待检测的样
8、品进行编号后，每样品取至少2个幼嫩叶片，用SEB作为抽提液(样品与SEB的比率为1: 10左右)进行榨汁，榨汁工具为微量样品榨汁机，没有微量样品榨汁机的则手工研靡，所得汁液直接用于检测。7 检测步骤7. 1 用CB将香石竹环斑病毒的抗体IgG根据供应商的说明稀释到工作浓度后.按每孔100L的包被酶联板。7.2 用封口膜式酶联板自带盖板对自每联极进行封盖，37C下放置1h或4C冰箱牌育过夜。7.3 按每孔200L的蠢用PBST洗板四次以上.每次1min, 7.4 按每孔100L的量加入待测样品，必须设立阳性对照、阴性对照和空白对照。并且待测样品、阳性对照、阴性对照和空白对照各至少有个重复。7.5
9、 对酶联板进行封盖，37C下放置1h或4C冰箱孵育过夜。7.6 按每孔200L的重用PBST洗板四次以上，每次1min, 7.7 按每孔100L的量加入工作浓度的香石竹环斑病毒的酶标抗体。7.8 对酶联板进行封盏，37C下放置1h或4C冰箱孵育过夜。7.9 按每孔20OL的量用PBS丁洗板四次.每次1min 7. 10 将底物按每孔8OL的量加入到酶联板.3幻7C显色30mi旧mf户，-白句、白的氧氧化铀或者5OL1 mol/L的硫酸终i止k反应。7. 11 用酶标仪于405nm处lWJJ定吸光值。8 结果判定将反应结果用酶标仪于405nm处读数，当样品的吸光值P大于O.25、阴性对照的吸光佳
10、N小于O. 1旦P/N大于2.。时，则为阳性，否则别为阴性。9 样晶保存对于检测结果为阳性的样品.必须对样品进行保存。保存方法为:将样品用SEB制成汁液.装入塑料样品管内或者离心管内于80C的温度下冷冻保存以备复查。山OON|N户户同军中华人民共和国出入境检验检疫行业标准香石竹环斑病毒血清学检测方法SN/丁1612-2005中国标准出版社出版发行北京复兴门外三旦河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷印张0.5字数7千字2005年11月第一次印刷开本880X12301/16 2005年11月第一版9峰定价6.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533书号:155066.2-16458 SN/丁16122005
