1、.、玉tz . I;r: i SN/T 1961. 1 2007 c 口口、，立目 Detection of allergen components in food一Part 1 : Protocol of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detecting peanut component 、2007-08-06发布2008-.03-01实施, 发布f SN/ T 1961.1 2007 目USN/ T 1961(食品中过敏原成分检测方法分为两个部分:第1部分:酶联免疫法检测花生成分;第2部分:实时荧光PCR法检测花生成分。本部分为
2、SN/T1961的第1部分。本部分检测方法是参照国际公职分析化学家协会(AOAC)和美国食品药品监督局(FDA)推荐使用的Neogen公司生产Veratox过敏原花生成分定量检测试剂盒的相关检测方法，经试验评估验证后编写提出的。本部分附录A为资料性附录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位:中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本部分主要起草人:罗茂凰、张霞、张海英、郑文杰、张海滨、高旗利、黎径。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 I , -SN/ T 1961. 1 2007 1 范围食品中过敏原成分检第1部分:酶联免疫法检方法花生成分SN/ T 1961的本部
3、分规定了食品中过敏原花生成分的酶联免疫检测方法。本部分适用于定量检测糕点、糖果、冰洪淋等食品中的过敏原花生成分，其他食品可参照使用。2 检测方法2. 1 方法提要I本方法的检测原理是夹心式酶联免疫吸附方法。将样品中提取出的花生蛋白质与抗体结合，加入酶标记的检测抗体，与己结合的花生蛋白质结合，结合的检测抗体与底物反应显现颜色，在酶标仪上读取吸光度，用标准对照物的吸光度作标准曲线，通过标准曲线计算出样品中过敏原花生成分的含呈。2.2 仪器设备及器2. 2. 1 天平:量程2kg，感量O.1 g。2.2.2 均质器。2.2.3 水浴、加热板或能保持600C土lOC的相当热帅。2. 2. 4 振蔼器。
4、2.2.5 离心机。2.2.6 50L200L可调移液器。2. 2.7 酶标仪:波长650nm。2.2.8 研钵及粉碎装置。2.2.9 试剂瓶:容量1L。2.2. 10 过敏原花生成分定量检测试剂盒，其组成参见附录A。2. 2. 11 洗板机。2. 3 试样制备取试样25g，用洁净研钵或合适的粉碎装置将样品粉碎至粉末状。2.4 试样提取1)2. 4. 1 提取液的预处理:取1L 10 mmol/L磷酸盐缓冲提取液，加盖，摇动混匀，置于水浴中，使提取液预热到600C。2.4. 2 取5g试样(液体试样取5mL)加到样品提取杯中，每个样品同时做两份平行梓。2. 4. 3 每个样品提取杯中加入1.0
5、g花生提取添加剂、125mL预热到600C的提取液，盖紧杯口。2.4.4 在600C水浴中以150、忧m摇动提取杯15min，之后静置5min使部分样品沉淀。2.4.5 取5mL提取液于14000r/min离心5minC或低速2500 r/min离心20min)，取上清液放至室温即可用于测试。2. 5 测试方法2)2. 5. 1 测试前应将所有的试剂恢复至室温080C300C)。1) 给出该信息是为了方便标准使用者，并不表示对产品操作步骤的认可，如其他产品操作步骤有不同，应经试验评估验证后采用。2) 给出该信息是为了方便标准使用者，并不表示对产品操作步骤的认可，如其他产品操作步骤有不同，应经试
6、验评估验证后采用。1 SN/T 196 1. 1 2007 2.5.2 取定数量的微孔，放在微孔支架上，标记标准液和测试样的位置。2. 5. 3 用移液器吸取100L标准液和样品测试液于微孔中，将微孔板在台面上以圆运动方式棍匀约20 s，在微孔上覆盖封孔膜，室温(l8C30C)孵育10min , 2. 5. 4 倒掉各微孔中的溶液，加洗涤缓冲液200L洗涤微孔，重复五次。将微孔倒置于吸水纸巾上，排除剩余的洗涤缓冲液。该步骤也可用洗板机进行洗涤。2.5.5 用移液器吸取100L酶标记结合物到每个微孔中，将微孔板在台面上以困运动方式混匀约20 S，在微孔上覆盖封孔膜，室温(l8C 30C)孵育10
7、min , 2.5. 6 重复3.5. 4洗涤微孔。2. 5.7 用移液器吸取100L底物搭液到每个微孔中，将微孔板在台面上以圆运动方式混匀约20S，在微孔上覆盖封孔膜，室面(l8C30C)孵育10min, 2. 5. 8 用移液器吸取100L终止2.5.9 用酶标仪测量每个微孔在62.6 结果计算及报告2)2. 6. 1 数据计算:读取OD值，根据计算式(1)，计算logi 式中:A , =2 OD,; A o=2 ODo, 示例:0标准溶液的吸光度ODo=0.072Ao= 2- 0.072 = 1. 5. 0g/mL标准溶液的吸光度ODs.oOlAs logits 5. 0 f1g/mL标
8、准溶液19值2.6.2 标准曲线绘制:以标准溶每次试验均应重新绘制标准曲线。2.6.3 计算每个样品的logit值，过敏原花生成分的含量X(g/mU可以直接得出样品中过敏原花生成分X 100 19值logit值2.6.4 如果样品的logit值高于标准溶液r冒值范围，应敏原花生成分含量应为X(g/mL)=稀释倍数X10日。圆运动方式混匀约20s。logit和19值。. ( 1 ) = 2. 64 ，绘制标准曲线(见附录A)。分含量19值B，样品中，输入每个检测样品的OD值品进行稀释后重新测试，则样品中过2.6.5 结果报告:若样品中过敏原花生成分含量大于等于2.5g/g(mU，报告样品中过敏原
9、花生成分含量为Xg/g(mU;若样品中过敏原花生成分含量小于2.5g/g(mL) ，报告样品中过敏原花生成分为阴性检测低限:2.5g/g(mUJ。2. 7 质控标准标准曲线的相关性应r大于0.995，否则检测元效，应重新检测。2 SN/ T 196 1. 1 2007 附录A(资料性附录)过敏原花生成分定量检测试剂盒A. 1 过敏原花生成分定量检测试剂盒本标准酶联免疫测定使用的试剂盒为美国Neogen公司产品3，试剂盒包括:a) 48个包被抗体微孔;b) 48个样品转移微孔;c) 标准榕掖:0g/mL，2.5g/mL，5.0g/mL，10.0g/mL，25.0g/mL; d) 酶标记结合物;e
10、) 底物恪液;f) 终止液;g) 洗涤缓冲液;h) 磷酸缓冲液;i) 提取添加剂;j ) 样品提取瓶。A.2 定范围检测低限:2.5fJ-g/mL(g)。定量FE围:2. 5g/mL(g) 25g/mLCg)。A.3 标准曲线4. 00 3. 50 3.00 相关性/泸0.9952. 50 2. 00 1. 50 1. 00 O. 50 O. 00 0.00 0.20 0. 40 0. 60 0.80 1. 00 1. 20 1. 40 1. 60 Igl (gl此)图A.1 过敏原花生成分检测标准曲线3) 给出该信息是为了方便标准使用者，并不表示对产品的认可，如其他产品经试验评估验证后，符合本标准要求也可采用。卜CCRY-FFUOF飞EU飞J ,_, . L J 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准食晶中过敏原成分检测方法1部分:酶联免疲法检测花生成分SN/ T 196 1. 1 2007 略中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:68523946中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷68517548 iz-!i 等印张0.-5字数7千字2007年11月第一次印刷1 2 000 祷1/16 开本880X1230 2007年11月第一版印7G 定价6.00书号:155066 2-18242 一1961.1-2007 w 、
