1、. 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SNjT 1962-2007 食品中克雷伯氏菌检测方法Detection of Klebsiella in food 2007-08-06发布2008-03-01实施系吏ift岳阳J中华人民共和国发布附哥?国家质量监督检验检痊总局前言本标准的附录A和附录B均为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口，本标准起草单位z中华人民共和国天津出入境检验检疫局，本标准主要起草人=高旗利、张霞、张海滨、郑文杰、罗茂凰、张海英、黎经。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。SN/T 1962-2007 I SN/T 1962-2007 食品中克雷伯民
2、菌检测方法1 范围本标准规定了食品中克雷伯氏茵(肺炎克雷伯氏商、产股克雷伯氏菌)的检测方法。本标准适用于食品中克雷伯氏茵(肺炎克雷伯民菌、产酸克雷伯氏茵)的检测。2 分类及定义2. 1 分类克雷伯氏菌CKlebsiella)为肠3. 11 VITEK全自动微生物分析系统或类似设备。4 培养基和试剂除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为蒸馆水。4. 1 缓冲蛋百陈水CRPW)，见附录第A.l章。4.2 肠杆菌增茵肉汤CEE肉汤)，见附录绍人2章。4.3 麦康凯肌醇阿东西F竣节青霉素琼脂CMIAC)，见附录第A.3章。4.4 氧化酶试验试剂见附录第A.4章。4.5 营养琼脐CNA)，见附录第A.5
3、载。SNjT 1962-2007 4.6 动力试验培养基2见附录第A.6章。4. 7 月l跺试验培养基及试弗IJ，见附录第A.7J衷。4.8 吐温-80，5 检测5. 1 方法提要食品中克雷伯氏菌的定性检测方法是通过对25g(mL)样品进行预增菌、选择性增商、分离及生化鉴定等方法对食品中可能存在的克雷伯氏菌进行定性检测B定量检测采用9管MPN法。5.2 检测程序克雷伯民荫的检测程序见图1，样品25g(mL) 225 mL的缓冲蛋白陈水(BPW)36C:!: 1C 18 h-22 h 10 mL绥神蛋白陈水(BPW)3X3管1 11日mLJm入90mL肠杆菌增菌肉汤(EE肉汤)5.3 定性检测3
4、6C士1C18 h-22 h 136C士1C18 h-22 h 10 mL肠杆菌增菌肉汤(EE肉汤)36C士1C18 h-22 h 接种MIAC平极36C士1C18 h-22 h 动力试验英膜染色革兰民染色氧化酶试驳API 20E或V1TEK图1克雷伯氏茵的检测程序5.3. 1 按无菌操作取检样25g(25 mL)至225mLBPW中，振摇使样品充分拍打或均质.36C士1C培养18h-22 h , 5.3.2 移取培养18h22 h的悬液10mL加入90mL EE肉汤中.36C士1C培养18h-22 h , 5.3.3 从选择性地茵的EE肉汤中月1直径3mm的接种环凹区法接种于MIAC平板.3
5、6C士1C培养18 h-22 h。观察平板上的菌落形态.在MIAC平板上，克雷伯氏茵的茵落形态为圆形、突起、湿润、光滑的红色菌落，直径为2mm ._, 4 mm。5.3.4 从MIAC平板上挑取5个可疑囱落分别做动力试验.并接种3lJNA平板上.36C土1C培养18 h-22 h , SN/T 1962-2007 5.3.5 将5.3.4中NA平板上的纯培养物做革兰氏染色、英膜染色、氧化酶试验。元动力，革兰氏染色阴性，有英膜，氧化酶试验阴性者，按表1进行生化鉴定。也可应用API20E生化鉴定试剂盒或VITEK生化鉴定系统进行生化鉴定。5.3.6 克雷伯氏菌属细菌生化特性见表L表1克雷伯氏茵属细
6、菌生化特性生化特性肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种肺炎克雷伯民菌臭鼻亚种肺炎克雷伯氏茵鼻硬结亚种产股克雷伯氏菌回到味十甲基红+ 十VP + (十拧校自2盐十(-) + 丙二般盐(十十(十)尿素酶(+ ) 十)赖氨酸脱竣酶+ d 十鸟氨自主脱殷酶果胶酸酶十O:-.lPG 十十+ 1OC生长+ 注，+，;主90%阳性，(十):75%-89%阳性，d不同菌株不定，(-)，75%-89%阴性;-:二月0%阴性。5.4 定量检测5.4. 1 按无菌操作取检样25g(25 mL).放入均质杯或均质袋巾加入225mL生理盐水，充分拍打或均质。若样品为高脂肪食品，需用O.1%1%吐温80的生理盐水制样;若样品为干酷或以
7、牛奶为基料的婴儿食品，需要将225mL生理盐水预热至45C.充分拍打或均质直到完全溶解。5.4.2 用1mL灭菌吸管吸取1: 10稀释液1mL，注入装有9mL生理盐水的试管中，振摇试管混合均匀，制成1: 100稀释液5.4.3 每一稀释度换取1支1mL灭菌吸管，按上项操作顺序进行10倍递增稀释。稀ffi数要依据样品污染情况而定。5.4.4 选择三个连续适宜的稀f1度，分别以1mL元菌吸管各吸取1mL稀释液，接种于10mL BPW 中，每一稀释度接种3管。样品的最芮稀释度应达到能获得阴性终点，置36C土lC培养18h22 h。5.4.5 轻轻混匀增菌液，每管增Lin液用3mm接种环(10L)接种
8、到10mL EE中，进行选择性增菌，36C士1C培养18h22 h。5.4.6 操作同6.3. 36. 3. 5。6 结果报告6. 1 定性检测结果报告根据生化鉴定结果报告每25g(mL)样品中检出或未检出何种或何亚种克雷伯氏菌。6.2 定量检测l结果报告生化鉴定结果符合克雷伯氏菌特性的菌株，按增菌坊养阳性管数，应用MPN表(见附录B).查出每克样品中的克雷伯氏菌MPN值。检验结果报告为每克样品中克雷伯氏茵属具体种或亚种的最近似值。3 SN/T 1962-2007 A.1 缓冲蛋白陈水(BP)A. 1. 1 成分蛋白JJ*氯化纳磷酸氮二纳磷酸二氢何蒸馆水A. 1. 2 制法附录A(规范性附录)
9、培养基和试剂10.0 g 5.0 l! i35在1. 5g E牛二_LQJlj弘立.lUL/ 7 将各成分加入蒸馆水中，加热煮沸至完醉，调节pli圣7.2土O.1.分装适宜容器.121c高压灭菌15min. A.2 肠杆菌增茵肉汤(EE肉汤)A. 2.1 成分蛋白豚葡萄糖磷酸氢二纳磷酸二氢何牛胆盐煌绿蒸馆水 J / 1 20;0 g / 俨气15l! /1;.。二dA.2.2 制法:J F j 应使用纯净的牛胆盐和煌绿如在少对l受损伤且数量极少jq丑杆茵的生长抑制。将各成分加人蒸惚水中，加热煮沸，调节pH至7.2士.l;分装适宜容器。115高压3俨恼15min，制成的培养基为绿色，可放置2C8
10、C冷藏柜保存.4周内民RJ./ ./ A.3 麦康凯肌醇阿东醇竣节青霉素琼脂(MIAC)A. 3.1 成分蛋白陈20.0 g 肌喜事5.0 g 阿东m!5.0 g 氯化纳5.0 g 猪胆盐5.0 g 琼脂15.0 g 蒸饱水1 000.0 mL A. 3. 2 哥哥法将各成分加入蒸馆水中，加热溶解，调节pH至7.1土0.2.加入0.1%结品紫水溶液1mL.1%中性4 SN/T 1962-2007 红水溶液5rnL，分装适当容器.1l5C高压灭菌15min，温度降至60C左右，加入100rng/mL竣节青霉素(经0.22m滤膜过滤除茵)1mL.充分混匀，制成平板备用。A.4 氧化酶试验试剂A.
11、4.1 成分四甲基对苯二胶蒸馆水A.4.2和J法1. 0g 100.0 mL 将四甲基对苯二胶溶于蒸馆水即可，现配现用。若装人棕色瓶中，放置于2C8C冰箱保存，可在配制后7d内使用。A.5 营养琼脂(NA)A. 5.1 成分蛋白陈牛肉浸膏氧化纳10.0 g J 3.卢/Og / 琼脂./ 15.0 g / 蒸馆水/ 1 000. (L白LA.5.2 制法! ! 将各成分加入蒸惚水中，加热院解，调节pH至7.3士O., 121 c高压灭菌15min，制成平板备用。A.6 动力试验培养基A. 6.1 成分胶蛋白陈氯化纳琼脂1 / I。二/ 蒸馆水I (1 oo.o mf A. 6. 2 制法I .
12、_J .1 将各成分加入蒸馆水中，加我溶解，调节pH至lad. 1.分装1);试管.121c高压灭菌15min. Il1100 注1，本表采用3个稀H皮.Ig(mL)、0.01g(mL)、O.OOlg(mL)，每个稀n度l种3告.注2.若接种量扩大i.f1i，1111宁相应缩小十f;若按种jJ缩小十倍，表中数字相应扩大十倍，. 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准食品中克雷伯氏茵检测方法SN/T 1962一2007峙中国标准出版社出版北京复兴门外三旦河北街16号邮政编码，100045网址电话，6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 开丰880X1230 1/1 6 印张0.75字数15千字2007年11月第一版2007年11月第一次印刷印数1-20峰书号，155066. 2-18244 定价8.元
