1、EE 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1980-2007 进出口动物源性食品中孕激素类药物残留量的检测方法高效液相色谱-质谱/质谱法Determination of progestogens residues in food of animal origin for import and export-HPLC-MS/MS method 2007-08-06发布2008-03-01实施并窗弘中华人民共和国发布性阳出国家质量监督检验检疫总局、主叫JSN/T 1980-2007 前言本标准的附录A和附录B均为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准由中华人民共
2、和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院负责起草。本标准主要起草人g林黎明、张鸿伟、岳振峰、朱坚、彭涛、察发、杜恒清、陈永平.本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。I 1 范围进出口动物源性食品中孕激素类药物残留量的检测方法高效液中目色i普-质i昔/质谱法S:.I/T 1980-2007 本标准规定了动物源性食品中17a一经孕阳、烯丙孕素、快诺Z卢刚、快li矶、美仑孕闹、甲地孕丽、孕丽、甲泾孕阳、氮地孕由司等九种孕激素类药物残留量的制样、液相色谓民谱!i页谐调l定和确证方法。木标准适用于内脏、肌肉、Y产队、野蛮
3、及牛奶等动物源件食捕中17a-泾孕酣、烯丙孕索、快诺孕阳、烘诺丽、美仑孕阁、甲地孕肌JI夺哥1、叩泾li!.司、氮地孕町等九种我激素类药物残臼量的测定。2规范性引用文件L.-一一一一二/下列文件中的条款通过本标准的寻呼的本标准向献。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订哇均匀，适用于本知准，然而.鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的刷版本纣岳不旧时J引用文件，其最新版本适m于本标准。GB!T 6682-1992 分析实联空用水创始幸卢3 样品制备与保存5 试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为GBfT6682-1992规定的一级水。5. 1
4、 乙睛，色i甘级。5.2 正己烧，色i晋级。5. 3 二氯甲炕.色i作级。5.4 月J醉，包谱级。5.5 冰乙酸，色i苦级。5.6 正丙晖，色i苦级。5. 7 乙股馁。1 SN/T 1980-2007 5.8 卢葡糖背硫酸酣酶。5.9 乙酸饺缓冲溶液z溶解11.6 g乙股饺(5.7)于980mL水中，用冰乙酸调节溶液pH值到5.2，最后用水稀释至1L. 5. 10 正己统二氯甲炕济液s取正己倪(5.2)80mL，二氯甲统(5.3)20mL，混合后振摇混匀。5. 11 C18 SPE柱，500mg, 3 mL，或相当者，使用前依次用5mL甲踪，5mL水活化.5. 12 标准物质，17经孕阴、知i
5、丙孕索、士是诸孕洞、醋酸快访阁、自3酸美仑孕町、l.1酸甲地孕酣、孕闹、醋胶甲经孕阳、氯地孕酣、17经孕酣08、孕酣09标准品z纯度二三95%0 5. 13 标准溶液=5. 13. 1 标准储备溶液=分别准确称取适量九种孕激素相应化合物标准品(5.12)，用乙脐溶解定容至100 mL，:f!质量浓度分别为1000g/mL的标准储备溶液。此储备液可在一20C以下避光存放6个月。5. 13.2 混合标准中间液:准确吸取各种孕激素类标准储备液(5.13. 1)适盘，用乙肩准确稀得到各种孕激素类药物的浓度为100g/L，此中间液可在一20C以下避光存放3个月。5. 13.3 低代内标储备溶液:分别准确
6、称取适量17经孕罔0，、孕酣-0，标准品(5.12)，分别用乙腊准确溶解并稀将至溶液rt，度为1000问ImL。此储备液可在20C以下避光存放6个月。临周前根据需要用乙脂稀释至适当浓度，作为混合标准内标工作液，一20C冰箱保存。5. 13.4 混合筑代内标中间液z准确吸取各种孕激素筑代内标储备液(5.13.3)适量于棕色容量瓶中，用乙脂准确确释至各种孕激素筑代内标物的浓度为100g/L，此中问液可在一20C以下避光存放3个月。5. 13.5 混合标准工作液2混合标准工作液根据需要使用前用空白样品基质溶液配器1) 6 仪器和设备6. 1 高效液相色i吉串联四级杆质谱仪或相当者，配有电喷雾离子源。
7、6.2 分析天平，fflO. 1 mg ,O. 01 g。6.3 旋转蒸发器。6.4 回相萃取装置。6.5 旋涡混合器。6.6 高速冷冻离心机，10000r/min. 6.7 移液枪，10L100L，100L1000L。6.8 pH t t-. 6.9 螺旋盖聚丙烯离心试管，50mL. 6. 10 组织捣碎机。6. 11 均质器。6. 12 超声波仪。6. 13 吹氮浓缩仪。6. 14 恒温水浴。6. 15 振荡器。7 测定步骤7. 1 样品提职称取试样3g(精确JlJO. 01 g)，置于50mL具螺旋盖聚丙烯离心管中，依次加入100L混合筑代内标中间液，加入5mL乙酸钱缓冲液(5.幻，在均
8、质器中均质30s.加入60L葡惦背硫股自旨荫(5.8)，j昆匀305，于40CtQ温水浴巾振摇过夜，然后放怜至窒泪，加入乙脂20mL.于涡旋混合器上混SN/T 1980-2007 合5min.超声提取10min，然后10000 r/min，一10C高速冷冻离心5min.收集上滔液于另一个干净的50mL具螺旋盖离心管中，加入20mL正己;皖二氯甲皖济液(5.10)，振摇5min.静置后，溶液分成上中下三层，吸取中间层(乙肪十二氯甲:院)溶液于梨形蒸发瓶中，剩余溶液再用10mL乙脂重复上述提取步骤，合并中间层(乙睛十二氯甲院)溶液于梨形蒸发瓶中，40C减压浓缩至干，加入0.5mL乙脐，5 mL水，
9、昆匀，待净化。7.2 固相萃取净化将C18固相萃取柱(5.11)安装在回相萃取装置上，依次以5mL甲醇和5mL水进行t;ti化，将样品提取液转移至C18萃取位中，控制i流速约每秒1滴。依次用5mL 10%甲醇水溶液和5mL 7j(淋洗柱子，淋洗液完全通过小柱后，加压至干，用6mL甲醇洗脱，洗脱液收集到梨形蒸发瓶中，在40C真空旋转蒸发至近干，再用氮气流吹干，加入0.5mL乙脂溶解残渣，涡旋混合1min，j日0.5mL水，混匀，过0.22m滤膜，供液相包i告/串联质谱仪测定。7.3 测定7.3. 1 液相色i曹条件a) 色谱柱，Kromasil605CN， 5m，250 mmX4. 6 mm(内
10、径)或相当者gb) 流动相:乙脑+水(70十30)，c) 流速，600L/min;d) 柱混，35C, e) 进样量，20pL。7.3.2 质谱条件a) 离子化模式z电顷雾;b) 扫描极性.iE离子扫描gc) 检测方式3多反应监测(MRM)，d) 分辨率z单位分辨率。其他参考质i昔条件参见附录A。7.3.3 高效渡相色谱质i曹/质i曹盟定根据试样中被测孕激素类药物残留的含量情况，选取响应倪相近的标准工作液一起进行色谱分析。标准工作液和待测液中九种孕激素的响应值均应在仪器线性响应范围内。对标准工作液和样液等体积参插进样进行测定.在上述色i古条件下各种孕激素类药物的参考保留时间为17-经孕丽的6.
11、2min , 烯丙孕素6.3min，快诺孕酬6.4 min，快诺嗣6.8mn，美仑孕酣6.8min，甲地孕酣6.8min，孕酣6.8 min，甲经孕酣6.9min，氯地孕酣7.2min标准溶液的多反应监测(MRM)色消图参见附录B.8 结果计算和表述8. 1 定性标准8. 1. 1 保留时间待i则样品中化合物色谱峰的保留时间与标准溶液相比变化范围应在土2.5%之内。8. 1. 2 信噪比待测化合物的定性离子的重构离子色W峰的信噪比应大子或等于3(S/N注3)，定量离子的重构离子色谱峙的信噪比应大于或等于10(S/N;?IO)。8. 1.3 定量离子、定性离子及子离子丰度比每种化合物的质谱定性离
12、子必须出现，至少应包括一个母离子和两个子离子，而且同一检测批次，对同一化合物，样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，其允许偏差不超过表l规定的范围。3 SN/T 1980-2007 表1定性时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度1%允许的相对偏差/%50 20-50 +20 土2510-20 士3010 土508.2 定量结果与表述采用内标法定量，按式(1)计算孕激素类残留含量。计算结果需扣除空白值。) 1 ( . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 式中.9 测定低限和回收率9. 1 测定低限.
13、6;市陆- , 悟出i即:ELA数据在不同的基质中，孕激素各f表2药物名称添加浓度/J 飞1 J吹求/(g!kg) E了组主忏J机内组织r gi纽到蜂蜜奶1. 00 导川1781. O，i; 118 788F i12 87.7-106 85.6-1 11a捏孕罔2.00 88、lC.)8:0-105 73JUo1 83.0-110 84.5-109 4.00 88.3-111 81.1-97.1 81. 1-101 81.3-105 94.5-109 1. 00 77.7-112 70.6-115 71. 9-110 75.8-101 10.8-118 烯芮孕素2.00 6.5-10-t 75
14、.5-109 80.0-105 78.0-102 84.5-105 4.00 83.0-101 78.3-105 81. 0-103 88.3-100 86.7-112 2.00 76.5-115 80.0-101 84.5-104 83.5-107 71. 5-102 快诺孕酣4.00 76.5-105 88.5-100 86.3-100 90.5-108 82.5-106 8.00 75.3-103 89.0-98.7 88.5-1. 07 81.0-106 82.5-101 1.口。80.8-109 91.6-106 7日.0-10579.0-106 70.6-112 快诺酣2.00 8
15、8.9-105 87.0-105 邸.5-10589.5-100 0.86-110 4.00 88.3-110 83.1-103 85.1-103 89.5-103 4 添加浓度/药物名称(g/kg) 肝组织1. 00 78.8-112 美仑孕翻2.00 76.5-102 4.00 79.0-105 1. 00 79.4-104 甲地孕酣2.00 82.0-103 4.00 83.3-105 1. 00 7.6-111 孕酣2.00 0.0-1. 01 4.00 k且_()=101i.1. 00 77.2-108 甲11孕酣2.00 79川0/4.00 76/105 1. 00 7.8-110
16、 氯地孕罔2.00 9.2-.105 4.口。18.7-108 L 表2(续肌肉组织79.9-102 93.5-106 89.0-105 87.6-103 84.0-101 79.0-105 73.3-103 84.5-106 町.Jl比2z44101 yr.-l03 79.5100 ;/ 880JVT0,2 3 76E盯. z 81. 0-102 旦旦旦j / J f y J J j , / / 回收率/%鱼组织82.3-104 88.0-105 89.7-103 75.4-100 79.0-98.0 89.0-99.7 80.0-1G3 79.5-103 . 91.0-功58()r王二10
17、4/84.0-106 89.0-101 ( J.。四川自79.5-1Q3 1 890-9吁7SN/T 1980-2007 蜂蜜68.6-112 81. 5-111 84.5-2.05 83.4-2 82.5-107 88.3-105 74.7-103 84.0-106 92.0-110 73.2-110 84.0-107 94.2-105 85.3-112 83.0-108 89.5-105 奶88.0-101 83.0-101 78.7-110 79.0-114 82.5-105 90.7-110 79.0-1. 11 81. 5-103 91. 5-105 80.7-106 89.5-10
18、3 91. 7-107 78.9-106 89.0-107 91. 3-102 p d SN/T 1980-2007 6 附录A(资料性附录)ABI4000型串联质谱仪参考质谱条件1)参考质谱条件Ea) 离子源g电喷雾离子源gb) 扫描方式=正离子扫描;c) 检测方式=多反应监视J(MRM), d) 分辨率z单位分辨率ge) 电喷雾电压(IS)，5000V，f) 雾化气压力(GSl),0. 24 MPa, g) 气帘气压力(CUR)，0.07MPa, u 辅助气流速(GS2),0. 55 MPa, i) 离子源温度50 20-50 intensitv/% 10-20 10 Permitted
19、:t 20 士25:t 30 士50tolerances! % 8.2 Calculation and result presentation The calculation of progestogens residue concentration in the sample is according to the following for mula. the blank value should be subtracted from the result of calculation: x = C X Ci X A X A Si X V x 1 ?O = _, x ( 1 ) CSi X
20、 A i X As x m . 1 000 where X -the residue content of phenothiazine in the test samp怡，g/kg，c-concentration of the residue in standard working solution.g/L; cs,-concentration of the internal standard in standard working solution.g/L; 15 SN/T 1980-2007 C，一concentrationof the internal standard in test
21、solution.月/L，As-Peak area of the residue in standard working solution, A-Peak area of the residue in test solution, ASi一Peakarea of the internal standard in standard working solution; A，一Peakarea of the internal standard in test solution, V-the final volume of the test sample. mL. m叮叫叫叫叫W附削咐叫e创啕峭ig刷
22、g趴h9 Limit of quantification and recover叩Y 9. 1 Limit of quantifi四tionFor the muscle. liv肘.milk. fish ti筝。白andhoney;- thezlitiiit of deteilllination for 17a-hydroxyproges terone. altrenogest. norethisteron. me阳ngestrol.megestrol. progesterone. medroxyprogesterone 。rmad巾Tab 2-Recovery of ea li何rn dif
23、f气AJ;二注:ixdmntspikelevek Compound Spike level/ 也，J Re合v盯/她g!kg) 三、)山e飞.ymu叫L fish j honey milk 1. 00 ￥6.4舌1171 81.0手1187B S112 87.7-106 85.6-109 17a.hydroxy. 2.00 主段:lm妒105795JE 1, 01 83.0-110 84.5-109 progesterone 4.00 ft7-97.7 L.,.l :7 -101 87.3-105 94.5-109 1. 00 77.7-112 70.6-115 71.9-110 75.8-1
24、01 70.8-118 altrenogest 2.00 76.5-104 75.5-109 80.0-105 78.0-102 84.5-105 4.00 83.0-101 78.3-105 81.0-103 88.3-100 86.7-112 2.00 76.5-115 80.0-101 84.5-104 83.5-107 71.5-102 norgestrel 4.00 76.5-105 88.5-100 86.3-100 90.5-108 82.5-106 8.00 75.3-103 89.0-98.7 88.5-1.07 87.0-106 82.5-101 1. 00 80.8-10
25、9 97.6-106 78.0-105 79.0-106 70.6-112 norethisterone 2.00 88.9-105 87.0-105 85.5-105 89.5-100 0.86-110 4.00 88.3-110 83.7-103 85.7-103 89.5-103 86.5-110 16 SN/T 1980-2007 Tab 2 (continued) Spike level/ Recoverv/% Com阳und(g/kg) liver muscle fish honey milk 1.00 78.8-112 79.9-102 82.3-104 68.6-112 88.
26、0-101 melengestrol 2.00 76.5-102 93.5-106 88.0-105 81.5-111 83.0-101 4.00 79.0-105 89.0-105 89.7-103 84.5-2.05 78.7-11口1.00 79.4-104 87.6-103 75.4-100 83.4-112 79.0-114 megestrol 2.00 82.0-103 84.0-101 79.0-98.0 82.5-107 82.5-105 4.00 83.3-105 79.0-105 89.0-99.7 88.3-105 9日7-1101.00 77: 6-111 73.3;1
27、03 80.0- 03 74.7-103 79.0-1.11 progesterone 2.00 80.0-1. 01 84.5-106 79.5- 03 84.0-106 81.5-103 4.00 lZjLQ-10 90.0-101 91.0- 05 92.0-11口91.5-105 1.00 77.2-108 j矿21038IY.S-104 73.2-110 80.7-106 medroxyproges-2.00 79.0-11,2- 79. 5 -100/， 84.0-106 84.0-107 89.5-103 terone 76;405 邸.甲1e0f3 4.00 89.0-101
28、94.2-105 91.7-107 1.00 份8-1107 I ;JU 06 85.3-112 78.9-106 chlormadinone 2.00 79.2-105 81.0-102 19.5- 03 日3.0-10889.0-107 4.00 83.7-108 80.5-103 89.0-9 .7 89.5-105 91.3-102 _ ， / 17 SNjT 1980-2007 Annex A ( Informative) Reference mass spectrometry conditions for API 4000 tandem mass spectrometry Refe
29、rence mass spectrometry conditions: al lon source: ESI: bl Scan mode: positive, c) Determination mode, MRM, dl Resolution: unit, e 1 lon spray voltage: 5 000 V, f) Nebulizer gas pressure: 0.24 MPa, g) Curtain gas pressure: 0.07 MPa, hl Auxiliary gas pressure:O. 55 MPa; 。Temperature:600t , j) Other m
30、ass operating conditions are listed in table A. 1. Table A. 1-Main MS parameters of progestogens Qualitative Ouantitative 口eclusteringCollision Entrance Compound lon阴阳(m/z)lon pairs(m!z) potential/V energy!V 四)tential/V17.hydroxy. 331.3/109.1 110 45 10 331.3/109.1 prc唱esterone331. 3/97.1 110 46 10 3
31、11.3/227.2 90 35 9 altrenogest 311.3/227.2 311.3/269. 2 90 25 9 313.2/245.2 90 28 11 norgestrel 313.2/109.2 313.2/109.2 90 44 11 341.3/281.2 100 24 10 norethisterone 341.3/281.2 341.3/109.2 100 45 10 1) Non-commercial statement I the reference mass parameters in Annex A are accomplished by API 4000
32、LC-MS/ MS. the equi阳nentand its type involved in the standard method is only for reference and not related to any mmercial aim.and the analysts are encouraged to use equipments of different corporation or different ty阳18 SN/T 1980-2007 Table A. 1 (continued) Qualitative Quantitative Declustering Col
33、lision Entrance Compound lon阳irs(m/z)ion阳irs(m/z)potential!V energy;V potent旧I!V397.3/337.2 80 22 10 melengestrol 397.3/337.2 397.3/279.2 80 32 10 385.4/325.2 70 23 12 megestrol 385.4/325.2 385.4/267.2 70 28 12 315.2/97.2 100 45 12 progesterol 315.2/109.2 315.2/109.2 1日。43 12 medroxy- 387.4/327.2 90
34、 23 10 387.4/327.2 progesterone 387.4/123.2 90 45 10 405.3/345.2 84 20 12 chlormadinone 405.3/345.2 405.3/309.2 84 24 12 17.hydroxy. 339.3/100.1 110 45 12 339.3/113.1 progesterone- 08 339.3/113.1 110 45 12 324.3/100.1 100 45 12 progesterone-D9 324.3/113.1 324.3/113.1 1 45 12 19 S:/T 1980-2007 Annex
35、B Clnformative) (2) 9 (,) 8 MRM Chromatograph of chemical standard 2. gef 2.5e4 2.0e 1. 5et 1. Oe 旦、dk z 口5000.0 -0.0 (1) 7 11 6 5545 5000 4000 3000 2000 1 000 。EUKD-EE-4 3 司11jr/ J mm阳m叫翩。EE-HU/ 9 5 tlmin 4 3 2 3000 2500 2000 150() 1000 500 0 且已huacsc-9 3 9 (8 ) 9 (6) 8 8 8 7 7 7;F fi- llIL 6 6 6 5
36、 6 flmin s 11m川, 5 t/min 7.21 4 4 4 2 3 4 s 3 2 2 1. 8 e4 1.6 1. 4 e4 1. 2 e 1. Oe4 8000.0 6000.0 4000.0 2000.0 。2.5e4 2.0e4 EQKUHmCUE-在 飞 z E 5000.0 1. 5e4 1.0e4 。(9) 2400 2000 nHJLCmdC川WM巳】1500 1000 500 9 (1)17a-hdroxyprogesterone; (4)-一-Norethisterone;(7) -Progesterone; (2)-Altrenogest, (5)一一-Mel
37、engestrol;(8) -Medro_xyprogesterone; (3) -Norgestrel; (6) -Megestrol; (9) -Chlormadinone Figure B. l-Multiple reaction monitoring(MRM)chromatogram of 9 progestogens residues of standard working solution(equals to concentration level of 5. 0 Ig/kg in sample) 8 7 6 5 tfmn 4 3 2 。20 SNjT 1980-2007 (2)
38、6.78 4.5c4 4.0c( 3.5e4 3.0e4 2.5e( 2.0e4 1.5巳41. Oe4 5000 。且b-ESE-(1) 6 1l 61J 2.0e4 1. 5c4 1. Oe4 EUZZEZM 5000. O (1)-17-hydroxprogesterone-D8 ; (2)-Progesterone-D9 Figure B.2- Multiple reaction monitoring(MRM)chromatogram of deterium-Iabelled internal standards of standard working solution (equals
39、 to concentration level of 25. 0g/kg is sample) 9 8 5 6 t/min 4 3 2 9 8 7 4 5 t/min 3 2 。21 ill川1II1111I中华人民共和国出入境检验检疫行业标准迸出口动物源性食品中孕激素类药物残留量的检测方法高效液相色谱-质i曹/质谱法S:-.I/T 19802007 峰中国标准出版社出版北京复兴门外兰里向北街16号邮政编码，100045阿址电话，6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷樨开本880X12301/16 印张1.75 字数38千字2007年11月第一版2007年11月第一次印刷印数12000 樨书号，155066.2-18261 定价14.00元
