1、中华人民共和国国家标准布鲁氏菌病诊断标准及处理原则GB 15988-1995 Diagnostic criteria and principles of management of brucellosis 1 主题内容与适用范围本标准规定了人群布鲁氏菌病简称布病）的诊断和疫区处理原则。丰标准适用于各类医疗、卫生防疫机构。2 术语皮肤过敏试验：受布氏菌感染后，再受到布氏菌过敏原剌激，皮肤出现的迟发型过敏反应。布州疫区：凡有新病人发生或有疫畜检出的自然村（屯或畜牧场（队）均视为布病疫区。检疫：月1特异性的血清学，皮肤试验，分离细菌等方法对人畜布病的检查。淘汰：kt杏出的阳性畜进行屠宰处理。3 有病
2、诊断布病是种严重地危害人民健康和畜牧业发展的人畜共患的传染病，染疫的家畜是人和畜间布病的主要传染源。3. 1 流行州学：发病自IJ病人与家畜或畜产品，布氏菌培养物有密切接触史，或生活在疫区的居民或与菌的生产、使用和研究有密切关系者。3. 2 临床表现：出现持续数目乃至数周发热（包括低热），多汗，肌肉和关节酸疼，乏力，兼或肝、脾、淋巴结和整丸肿大等可疑症状及体征。3. 3 实验室检查：布病破片或虎红平板凝集反应阳性或可疑，或皮肤过敏试验后24、48h分别观察1次，皮肤幻目中浸润范南有一次在2.。cm2.Gem及以I二（或4.Ocm以上）。3.4 分离细菌：从病人血液、骨髓、其他体液及排泄物中分离
3、到布氏菌。3. 5 血清学检查标准试管凝集试验。AT）滴度为1 100及以上；对半年内有布氏茵茵接种史者，SAr滴度虽达1 100及以t，过24周后应再检查，滴度升高4倍及以上g或用补体结合试验CCFT)检聋儿、川、滴度l I 0及以上；抗人免疫球蛋白实验（Coombs）滴度1 400及以上。疑似病例：具备3.1、3.2和3.3者。确诊病例疑似病例加3.4或3.5中任何一种方法阳性者。4 疫区处理原则4. 1 核实诊断：对确诊的病人应依据流行病学资料，临床表现和实验室检查结果进行核实诊断。国家技术监督局199512 15批准1996-07-01实施GB 15988 1995 4.2 检疫和淘汰
4、处理疫畜：对疫区内全部羊，牛和猪用血清学方法进行检疫，检疫后1个月再检一次。凡险出的阳性家畜均应立即屠宰（或隔离饲养）。至少在一年内停止向外调运牛、羊、猪。畜产品均应在原地f.放和消毒，暂不外运。4. 3 消毒：被病畜的流产物污染的场地、用具、圈舍及尚未食用的奶制品均应进行消毒处理。4.4 免疫：经两次检疫呈阴性反应的家畜，以及疫区周围村受威害的畜群，应连续3年以畜用菌苗进行免疫每年免疫覆盖率不应低于90%。4. 5 临床监测及治疗：对疫区内接触家畜及畜产品的人员进行血清学及皮肤过敏试验，查明人群感染情况，凡确诊的病人均应进行系统治疗。4.6宣传教育：对疫区的居民及职业人群进行布病的危害、临床
5、表现及防治知识的宣传教育。4. 7疫区处理效果验证2在疫区处理后的第二年始，连续三年对疫区及疫区周围地区进行验证，验证方法按照农业部和卫生部共同制定的布病疫区控制考核标准的要求进行。:J I (i GB 15988 1995 附录A布鲁氏菌病诊断的特异性实验室检查技术（补充件）A1 从可疑布病患者分离布鲁氏菌A 1. 1 血培养A1.1.1 双相培养基培养z无菌从可疑病人静脉取血液45ml，在酒精灯火焰附近将血液注入56支含双丰tl培养基的中试管内，或24只含双相培基烧瓶中，轻轻混合倾斜使被检血液分布在琼脂斜面t . ，可37（温箱培养，如果怀疑病人是牛种布鲁氏菌感染时.Jl有一半标本宦C（）
6、，环境中培养，三天后观察结果，如未见布氏菌生长，可按上法再倾斜，使血液涂在琼脂斜面上，继续培养，每隔一天观察次，如高可疑布何氏菌落，可用铅金耳勾出接种到琼脂试管培基获得纯培养进一步作布氏菌鉴定，血培养三1天仍不出的，可定为阴性。A1.1.2 接种未受精鸡卵法：取新鲜鸡蛋两个，把鸡蛋放在固定架上，锐端向上以腆酒和酒精依次消毒蛋壳，用眼科手术刀在顶部穿一小孔，用三厘米长注射针头将被检血液徐徐注入卵黄中，每个鸡蛋援种血液。.2ml，立即用灭菌石蜡将孔密封，置37c温箱中培养，五天后把接种血液的鸡蛋无菌打开，用火菌的毛细管把接种血液部分的卵黄及蛋清吸出0.5 0. 6mL.接种23支斜面培养基上，贵3
7、7C培养.23天观察次，15天仍不见可疑菌落生长，定为阴性。A 1. 2 骨髓培养用灭菌的导尿管将尿液导出放入灭菌容器中，为浓缩细菌，提高检出率，可在尿液中加入1%3灼的高价布fI氏菌免疫血清，混合后，直37c温箱拙，高速离心沉淀，取沉淀物0.5ml，接种在选择性培基上增养或注射豚鼠，用生物学法分离布鲁氏菌。A 1. 3 其他病原材料培养由乳，脑脊液，关节液和滑囊液分离布鲁氏菌，将液体标本无菌地接种到琼脂斜而上，或培养平板上涂布于培基表面，参照血培养法观察结果，15天仍无可疑菌生长，定为阴性。A 1. 4 生物学分离布鲁氏菌法为了提高对布鲁氏菌的检出率和从污染的材料中分离布鲁氏菌，将被检材料（
8、团体标本加灭菌的生理盐水研碾成浆液态）经皮下或腹腔注射豚鼠或小臼鼠，豚鼠接种lmJ,1J、鼠接种o.5mL，接种豚鼠，即可现察血清变态反应情况，又可作细菌分离培养，小鼠感染后二十天解剖取脏器培养，豚鼠接种后三卡天解剖取脏器培养。A2 特异性血清学检查A2. 1 平板凝集试验（PAT)A2. 1. 1 器材及试剂赫德逊氏凹玻板或一块清洁无油脂玻璃板，平板凝集抗服，被检血清，己知阴性和阳性血清，O.lmL 吸管或微量加样器，牙签或细铁丝。A2. 1. 2 操作方法A2.1.2.1 备一方形洁净的玻璃板，划成25个方格（或更多），横数5格，纵数5格，第J列各格写r:血清号码。A2.1.2.2 用。l
9、ml，吸管按r列剂量加受检血清于任何一行（横格）的各格中第一格0.08ml，第二恪0.Olmi，第二格0.02mL，第四格。.OlmL。A2.1.2.3 加平板凝集抗原o.03mL于各血清格中，用牙签或细铁丝混合，由血清量最小的格i昆起每GB 15988-1995 份血清用一根牙签混合即可，用后烧毁，若用细铁丝混合时，每份血清混合后用酒精棉球擦净，然后再用作另一份血清。A2. 1. 2. 4 混匀后将玻璃板置于酒精灯火焰或凝集反应箱上，均匀加温，使其达到30左右，5min内记录反应结果。A2.1.2.5每次试验用阴、阳性血清各1份作对照。A2. 1. 2. 6按下列标准用加号记录反应强度：，出
10、现大的凝集片或小的粒状物，液体完全透明，100%凝集。+ ：有明显的凝集片，液体几乎完全透明，75%凝集。+ z有可见的凝集片，液体不甚透明，50%凝集。+ 液体混浊，只有少量粒状物，25%凝集。z液体均匀混浊。A2. 1. 2. 7平板凝集反应与试管凝集反应的关系g0. 08mL血清量出现凝集相当于试管法1 25的血清稀释度，o.04mL相当于150,0. OZmL相当于1 100,0. Olm！，相当于1 zoo 0 A2. 1. 3 判定人血清0.OZmL出现及以上凝集程度判为阳性，人血清0.04mL出现十及以上凝集程度判为可疑。A2. 2 虎红平板凝集试验（RBPTlA2. 2. 1
11、器材及试剂清洁脱脂玻片或有凹型孔的玻片，o.lmL吸管或微量加样器，牙签或细铁丝，虎红平板凝集抗原，被检血清。A2. 2. 2操作方法在玻片上加0.03mL被检血清，然后加入虎红平板抗原o.03mL，摇匀或用牙签混匀，在5min内判定结果。A2. 2. 3判定判定凝集程度（至）同平板凝集反应；亦可只分为）阳性，一）阴性两类。A2. 3试管凝集试验（SAT)A2. 3. 1 器材及试剂试管凝集抗原，被检血清，o.5%的石碳酸生理盐水，吸管，凝集试管，温箱和试管架等。A2. 3. 2 操作方法A2. 3.2. 1 被检血清的稀释：在一般情况下，每份血清用5支小试管（口径8lOmm），第一管加入Z.
12、 3mL石碳酸生理盐水，第二试管不加，第三、四、五管各加O.5mL，用lmL吸管吸取被检血清0.ZmL, 加入第一管中混匀。混匀后，以该吸管吸取第一管中血清加入第二管和第三管各0.5mL，以该吸管将第三管混匀，并吸取0.5ml，加入第四管，混匀。再从第四管吸取o.5mL，弃去。如此稀释后，从第二管到第五管血清稀释度分别为I12.5,1 25,1 50和1 100. A2. 3. 2. 2 加入抗原z先以o.5%石碳酸生理盐水将抗原原液作适当稀释般是作110稀释。稀释后的抗原加入各稀释的血清管（第一管不加，作为血清对照），每管加0.5mL，混匀。加入抗原后，每管总量lmL，血清稀释度从第二管至第
13、五管分别为I25,J 50,1 JOO和I 200，从第一管再吸出0. 5mL，剩lml,.A2. 3. 2. 3对照z阴性血清对照，血清稀释后加抗原（与被检血清对照相似阳性血清对照，其血清稀释到原有滴度，再加抗原，抗原对照，适当稀释的抗原加石碳酸盐水。A2. 3. 3 判定A2. 3. 3. 1 判定比浊管制备：每次试验须配制比浊管作为判定的依据。配制方法是：取本次试验用的抗318 GB 15988 1995 原稀释液5！OmL，加入等茧的o.5%碳酸盐水作倍比稀释，按表Al配制比浊管。表Al比浊管配制记标+ + + + 度100% 75% 50% 25% 0% 亮情碳酸盐水，mLI 00
14、0. 75 0 50 0. 25 0.00 抗原稀释度，mL0.00 0. 25 0.50 0. 75 I. 00 号l2345 管A2.3.3.2 全部试验管，对照管及比浊管充分振荡后置37温箱中2022h，取出后放室温2h，然后以比浊管为标准判定结果。A2.3.3.3 记录结果z根据各管中上层液体的清亮度记录结果。特别是50%清亮度（十对判定结果关系较大，一定要与比浊管对比判定。十十完全凝集，上层液100%清亮。几乎完全凝集，上层液75%清亮。，显著凝集，液体50%清亮。：有微量凝集，液体25%清亮。无凝集，液体不清亮。确定每份血清滴度是以出现及以上的凝集现象的最高血清稀释度。A2. 4
15、抗人免疫球蛋白试验（COOMBS)A2. 4. 1 器材及试剂除试管凝集试验所需的一般器材及试剂外，还需抗人免疫球蛋白血清及普通离心机。A2. 4. 2操作方法A2.4.2.1 试管凝集试验阶段：按AZ.3进行试管凝集试验。A2.4.2.2 抗免疫球蛋白的反应阶段选取试管凝集试验的可疑反应管及全部阴性反应管，记录管号，经4000r/min离心！5min，用生理盐水反复洗涤三次，然后向各管中加入生理盐水o.5mL、一定稀释度（一般是I 20倍稀释）的抗人免疫球蛋白血清，混匀，将反应管置37温箱中2022h，取出放室温2h后判定结果。A2.4.2.3 判定判定结果的标准，程度均同试管凝集试验。A2
16、. 5 补体结合试验（CFT)A2. 5. 1 器材及试剂37 c水浴箱，普通离心机，普通冰箱，各种容量的吸管，烧瓶，凝集管和试管架，生理盐水，补体新鲜豚鼠血清，或冻干补体）.2%的绵羊红细胞悬液，溶血素，补体结合抗原，阴性和阳性血清，被检血清。A2. 5. 2操竹f法A2. 5. 2. 1 补体滴度z在进行CFT时，必须当天滴定补体，将补体用生理盐水稀释为I 20，通常在十支凝集管中分别依次加入不同量的I 20稀释补体0.02 0. 2ml，然后各管中加入2个单位的抗原液。.2mL，再用生理盐水把各管补至0.6mL，混匀后放31c水浴中30min，再加0.2mL的溶血素（2个单位）和2%红细
17、胞0.2mL，混匀，置37水浴中30min,Jlj定结果见表A2l。表AZ补体滴度程序和结果xt 1. 抗原补体溶血章0. 2 ml, O. 12 0 10 O. CB 0. 2 o. 2 0. 2 0.28 o. 30 0 32 37C水浴30min0. 2 0. 2 0 2 o. 2 0 2 o. 2 37水浴30mintt-+ilt 一t-1-t+t-t- +it+ 十斗斗自十0 6 0.4 0 2 0 4 10 0.02 0.2 0.38 9 0. 04 0. 2 o. 36 8 0.06 0. 2 0 34 7 6 5 4 0 14 0.2 0.26 3 0 16 0. 2 0.24
18、 2 。180 2 0. 22 1 222 000 号l 20补体量2单位抗原量生理盐；j(量管。.2 o. 2 0. 2 0. 2 0.2 0. 2 0.2 0.2 0. 2 0.2 0.2 0. 2 0. 2 0 2 0. 2 0.2 0. 2 0 2 0 2 0. 2 2单位溶血章量2%SRBC量+I oi9 I + 结果举例GB 15988 1995 上例中产生完全溶血且合补体量最少管为第八管，定为一个恰定单位，前一管（即第七管）为个完全单位。在正式试验时采用两个完全单位的补体量，按式（Al）计算出补体稀释倍数X。20 2Y=X 0.2 (Al) 式中zy 1个完全单位补体量。20 o
19、. 2 2 X一一一一一一，Y=O08, 2Y Y X=-1_=25。即补体作1 25倍稀释。.08 A2.5.2.2 溶血素及抗原滴定z在进行CFT时溶血素和抗原亦需滴定，但不必在试验当天进行g而且，在购到此二试剂时出售单位（或提供单位都已滴定了，需用单位按说明稀释即可。A2. 5. 2. 3被检血清灭活z人血清灭活补体的温度是56，时间为30min0A2.5.2.4 本试验z灭活后的被检血清从1 5稀释开始，然后作倍比稀释，每管中稀释血清量为0. 2mL，再向各管中加2个单位抗原0.2mL,2个单位补体量。2ml，混匀，置37水浴中30min，取出后，向各管加0.4mL的溶血素，再放37水
20、浴中作用30min，判定结果（见表A3）。表A3CFT本试验程序mL 成分血情稀释度血清对照补体对照抗原I 80 0. 5单位10单位2单位I 5 I 10 I 20 I 40 I 160 I 5 被检血清0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 2个单位抗原0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0 2 0.2 0.2 2个单位补体0 2 0 2 0 2 0 2 0.2 0 2 o. 2 0 05 0 I 0 2 生理盐水0 2 0 35 0.3 0.2 37c水浴30min溶血章（熔血章绵羊红0. 4 0. 4 0 4 0 4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4
21、0.4 37 c水浴30min结果举例十十十+ A2. 5. 3 判定，无溶血，SRBC沉于管底或悬浮。，25%溶血。，50%溶血。，75%溶血。，100%溶血。以50%+l及以上不溶血确定CFT的滴度。为防止判定的错误，可配制标准溶血管（见表A4）。表A4标准溶血管的配制mL 管号2%SRBC I 0 2 2 0. 13 3 0. I 0 4 0.07 5 0 00 A3 皮肤过敏试验A3. 1 器材及试剂2%SRBC溶血素抗原补体0 00 0 2 0 2 0 01 0 2 0 2 0 10 0 2 0 2 0 13 0. 2 0 2 0 20 0 2 0 2 布fl氏菌素，75%酒精棉球，
22、结核菌素注射器，皮内注射针头，测量尺。A3. 2 操作方法生理盐水标准溶血程度）0. 4 十。.4 十o. 4 十0. 4 十。.4 子被检者前臂内侧1/3处，用酒精棉球消毒后，晾干，皮内注射O.lmL布鲁氏菌素在注射后24和48h作两次观察。320 GB 15988 1995 A3. 3 判定两次观察，以反应最强的结果为准，注射局部出现充血，浸润为2.Ocm 2 . 0cm及以上（或以反应面积二三4.Ocm），判为阳性。附加说明：本标准由中华人民共和国E生部提出。本标准由中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所负责起草。本标准主要起草人尚德秋、舒光亚。本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部传染病防治监督管理办公室负责解释。:l2 l
