1、GB 15997 1995 前言自喉是由自喉杆菌引起的急性呼吸道传染病。其感染特征为咽、喉、鼻部等处粘膜充血，肿胀并有灰白色假膜形成，以及细菌外毒案引起的全身中毒症状，严重者常合并心肌炎和末梢神经麻痹。由于白喉茵茵（百臼破三联制剂）的广泛应用，典型自喉逐渐减少，不典型自喉或轻型自喉日渐增多，尤其成人自喉的发病应引起关注。本标准在制定过程中，参考了1989年卫生部制定的中华人民共和国传染病防治法及中华人民共和国传染病防治法实施办法，尽量结合我国流行病学，临床实践和各地情况，以便易于实施和应用。本标准的附录A是标准的附录g本标准的附录B、附录C都是提示的附录。本标准由中华人民共和国卫生部提出。本标
2、准起草单位z中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所、北京市地坛医院、首都儿科研究所。本标准主要起草人：张荣珍、杨立信、玉树山。本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部传染病防治监督管理办公室负责解释。,q 中华人民共和国国家标准GB 15997-1995 自喉诊断标准及处理原则Diagnostic criteria and principles of management of diphtheria 1 范围本标准规定自喉的诊断标准和处理原则。本标准适用于作r、件EI 疗、Tl生、保健机构和人员对自喉病人的诊断、报告和处理。2 诊断原则以根据流行病学资料、临床表现及咽拭子细菌学涂片结果做出临床诊
3、断；确诊则需白喉杆菌培养阳性，日证明能产生毒素或检出臼喉特异性抗体。3 诊断标准3- 1 流行病学史内喉流行tv,_1孔，与确诊白喉病人有直接或间接接触史。3-2 临床川J:,: 发热、日因痛、如塞、声音嘶哑、犬吠样咳嗽。鼻、咽、喉部有不易剥落的灰白色假膜，剥时易出血。3. 3 实验室珍断3. 3. 1 白喉棒状杆菌分离培养阳性并证明能产生外毒素，见附录Ao3. 3. 2 日因拭f直接涂片镜检可见革兰氏阳性棒状杆菌，并有异染颗粒。3.3. 3 病人双份血清特异性抗体四倍以上增长，见附录C。3.4 病例分类3. 4. 1 疑似病例具有3.2者。3.4. 2 临床诊断病例疑似病例加3.3. 2.参
4、考3.I o 3.4. 3 确诊病例疑似病例加3.3. I、3.3. 3任何条者。4 防治原则4. 1 Jj人的隔离发现疑似或珍断病例，应立即隔离，隔离期至症状消失后，”因拭子两次细菌培养阴性为ti:.或症状消失fr;97 GB 1 5 9 9 7 1 9 9 5 血球。C1. 3. 2 血球醒化取上述压积血球1份，加入24份冷却的1%戊二隆溶液中，放26c，固定时间大于等于30min, 每56min摇动一次，离心（2000 r/min,10 min）弃上滑，用生理盐水洗五次，再用蒸馆水洗五次，最后用生理盐水配成10%血球悬液，加入1 10 000硫柳柔防腐，放28冷库备用。C1. 3. 3
5、血球致敏10%醒化血球悬液，白类用pH7.2磷酸盐缓冲液（P.B.S）稀释至2.5%后进行草草酸处理。a）草草酸处理2. 5%血球一份加1: 10 000的螺酸一份，混匀后放45c或37水浴30min（每56min摇一次），然后用pH7.2磷酸盐缓冲液（P.B.S）洗涤三次（2000 2 500 r/min,5 6 min），最后用pH6.4磷酸盐缓冲液（P.B.S）配成2.5%蹂化血球悬液。b）致敏2. 5%蹂化血球一份加精ifi!J臼喉类毒素一份（25Lf/mL）加pH6.4磷酸盐缓冲液（P.B.S）三份置45或37水浴30min（须经常摇动），离心弃上清，用0.5%兔血清生理盐水洗涤二次
6、，再用0.5%兔血清生理盐水配成2.5%血球悬液。C1. 3. 4 对照血球制备2. 5%草案化血球份加4份pH6.4磷酸盐缓冲液（P.B.S）置45c或37水浴30min（须经常摇动），离心弃上滑，用0.5%兔血清生理盐水洗涤血球二次，再用兔血清生理盐水配成2.5%对照血球悬液。c1. 4 效价滴定C1. 4. 1 致敏血球、敏感度的测定将标准臼喉抗毒素用0.5%兔血清生理盐水先行稀释使每毫升含1个单位，然后再以倍比法进行一系列稀释，自I: 2 1 : 4 096，每个稀释度取一滴（0.025 mL）加入血凝板孔中，再加入致敏血球一滴(O. 025 mL），摇匀放372h，取出判读结果或放冰
7、箱，次晨判读结果，以“”为凝集试验终点。臼喉类毒素致敏血球的敏感度不能低于o.003 906 JU /mL。同时作两种对照za）不同稀释度抗血清加辑化血球以检查抗血清有无非特异性凝集gb) o. 5%兔血清生理盐水加致敏血球以检查血球有否自凝作用。以上两种对照皆为阴性试验才能成立，否则应重试。C1. 4. 2 待检血清处理a）经5630min灭活。b）睦化血球吸收。吸收方法待检血清1份加50%隆化血球2份，放37c l 2 h，离心沉淀，吸取上清即为1: 2稀释的血清样品。C1. 4. 3 待检血清滴定先在血凝板中每孔加入0.5%兔血清生理盐水滴（0.025 mL），再将待检血清用微量漓管滴入
8、第孔中（0.025 mL），使与0.5%兔血清生理盐水混合，注意不要发生气泡，混匀血清后，每孔均取0. 025 ml，加入到第二孔中。混匀后自第二孔中吸出o.025 mL到第三孔中，如此类推，最后一孔取出0. 025 ml，弃掉。或用o.025 mL的稀释棒自第2孔开始作系列稀释。用微量滴管吸取O.025 mL O. 5% 致敏血球加到每个孔中，加时滴管勿碰到孔壁，以免沾有抗血清。然后摇匀，放.37C2 h取出，放210冰箱内次日晨判读结果，以“”为凝集试验终点。每份待检血清可做三个稀释度抗血清加螺酸血球的对照，稀释方法如前所述（即12,14,18），以排除血清中非特异凝集。c1.4.4 结果
9、计算待检血清单位待检血清终点稀释度标准血清终点稀释度所含单位数。例如标准臼喉抗毒素(10 IU/mL）终点稀释度为1: 2 048，含有o.004 8 IU/mL，而待检血清终点稀释度为l: 8，于是其单位398 GB 15997-1995 为o.038 JU /ml, Cl. 4. 5 结果判定标准a）凝集的红血球均匀地铺在孔底形成一薄层为“十十十”bl凝集的红血球基本同a），只是在此薄层的底部有很弱红圈为“”; c）凝集的红血球在孔底形成的薄层，同时中间可见松散的红圈为“”; d）凝集的红血球在孔底形成一圆圈，周围可见少量的红血球比对照圆圈稍大为“”se）血球在孔底形成紧密的圆圈成圆点为“
10、”。影响血凝试验的准确性与敏感度因素很多，如用具的清洁，材料的标准化，操作的细致等。C2酶联免疫吸附试验检测白喉霉素抗体c2. 1 原理利用包被在回相载体上白喉类毒素捕捉待检血清中相应抗毒素抗体，再用酶标记的抗人lgG抗体去掉反应抗原一抗体酶标记抗抗体，利用底物使酶显色而测知是否存在抗体。c2. 2 材料c2. 2. 1 抗原精制j白喉类毒素I110 Lf/mL。c2. 2. 2 结合物羊抗人lgG酶标记抗体。c2. 2. 3 载体1 cm4cm聚苯乙烯塑料管平底带盖。c2. 2. 4 底物邻苯二胶。c2. 2. 5 参考血清多份间接血凝法阳性高效价血清混合为阳性参考血清，多份阴性血清混合为阴
11、性参考血清。c2. 2. 6 被检血清白喉暴发流行区的病人和健康者。c2. 2. 7 测定仪721型分光光度计。c2. 3 方法及步骤c2. 3. 1 包被抗原量及被检血清最适稀释倍数的确定用阳性及阴性参考血清与抗原作方阵式滴定，确定本试验包被抗原浓度为20昭mL，被检血清最适起始稀释度为1; 40 0 c2. 3. 2 参考血清标准曲线绘制阳性及阴性参考血清均从1; 40开始至10240二倍法稀释，反应结果用721型分光光度计测光密度。D值，Y=492nm0本试验取三次测定结果的均值，以血清稀释度为横坐标，相对应的OD值为纵坐标，画曲线g然后用相关回归法确定OD值与血清稀释倍数相对应的标准曲
12、线。阳性血清最高OD值为0. 6，最低为0.I。因阳性和阴性血清呈明显差别的界限。D值为0.3处，故确定（）D值大于等于0.3为阳性，其所对1恒的血清稀释度为1; 2 560，即为一个单位。每份被检血清稀释度为1; 40，效价从标准曲线查出。经测算，两系数的P值皆小于0.01。c2. 3. 3 抗原包被每管加巳稀释好的抗原！.o mL，放4过夜，然后用pH7.2磷酸盐缓冲液（P.B.Sl吐温20洗涤三次，两次之间静止3min。c2. 3. 4 2日被检血清！.0 mL，置室温2h，再洗涤三次，方法同前。:; !l 9 GB 1 5 9 9 7 - 1 9 9 5 c2. 3. 5 加结合物（1
13、 8 000)1. 0 mL，室温2h，洗涤同前。c2. 3. 6 加底物液（0.04%)1.0mL，室温下30min，加2mol/L硫酸0.015 mL，如终止反应立即测OD值。C3 固相放射免疫法测自喉抗体C3. 1 基本原理固相放射免疫分析法（SPRIA）是应用双抗体法，以纯化的自喉类毒素吸附到固相载体上，加入特异性抗血清，载体上形成抗原抗体复合物。然后再加入标有同位素的第二抗体，就形成抗原抗体抗抗体复合物，通过测定标记的第二抗体的放射性就可确定相应抗体的含量。C3. 2材料和方法C3. 2. 1 血清标本来源人群臼喉抗体水平检测对象，多为采集儿童血清标本。C3. 2. 2精制臼喉类毒素
14、进一步纯化，经SephadexG-200过滤，测其浓度。C3. 2. 3 抗血清标准晶C3. 2. 4 第二抗体及标化法以马抗人lgG（经纯化）作为第二抗体，参照格林伍德（GreeWood）和亨特（Hunter）的高比度标化法进行放射磺化标化获得的I马抗人lgG。C3. 2. 5 固相载体U型聚氯乙烯软塑料板。C3. 2. 6缓冲液及填充液a）缓冲液，PBST，即含0.05%吐温20的0.Ol .mol/LpH7. 4磷酸缓冲盐水。b）稀释液，PBST-BSA，即在缓冲液中加入0.5%的牛血清臼蛋白。c）填充液，PBSBSA，即在稀释液中减去吐温20.C3. 3 操作方法C3. 3. 1 包被
15、抗原，用碳酸缓冲液（pH9.6）将精lliJ白喉类毒素稀释成5问mL，加入聚氯乙烯板各孔100 L，置4冰箱过夜。C3. 3. 2 将抗原溶液甩净，用PBST洗5次，每1次静置lmin左右，每孔加满填充液，将板放入湿盒内，37孵育1h，通过水泵将填充液吸净。C3. 3. 3 每孔加入用PBSTBSAl 20稀释的血清标本100L（做双份），37孵育2h，吸掉孔内液体，用PBST洗5次。C3. 3. 4 每孔加入20万CPMI标记的马抗人免疫球蛋白（山IlgG)lOO L,37保温2h，吸掉液体后用PBST洗5次吸净待干。C3. 3. 5 用剪刀将聚氯乙烯软塑料板上的各孔剪下来，进行放射性测量，每孔计数1min, C3. 3. 6 以不同稀释度的标准品所得结果在坐标纸上划出标准曲线，用每份标本双孔的平均值，在标准曲线上查出相应的抗毒素IU/mL。I O
