1、GB 15998 1995 前言百日咳是百日咳杆菌引起的呼吸道传染病，传染性强，在婴幼儿中有很高的病死率。临床表现以阵发性主主李性咳嗽和在咳终止时出现鸡鸣样吸气吼声为特征，多见于儿童，病程可达23个月。标准在制定过程中，参考了1989年卫生部制定的中华人民共和国传染病防治法及中华人民共和国传染病防治法实施办法中的诊断标准，尽量结合我国百日咳的流行病学，临床实践与各地情况，以便易于实施和应用。本标准附录A是标准的附录；本标准附录B是提示的附录。本标准由中华人民共和国卫生部提出。本标准起草单位z中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所、北京市地坛医院、首都儿科研究所。本标准主要起草人2张荣珍、杨立
2、信、玉树山。本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部传染病防治监督管理办公室负责解释。I I 1 范围中华人民共和国国家标准百日咳诊断标准及处理原则Diagnostic criteria and principles 。fmanagem四tof pertussis 本标准规定了百日咳的诊断标准和处理原则。GB 15998一1995本标准适用于各级、各类医疗、卫生、保健机构和人员对百日咳病人的诊断、报告和处理。2诊断原则应根据流行病学资料及l临床表现做出临床诊断，确诊需要百日咳杆菌培养阳性或者检测抗百日咳菌特异性抗体。3诊断标准3. 1 流行病学史三周内接触过百日咳病人，或该地区有百日咳流行。3.2
3、 临床表现3, 2. 1 流行季节有阵发性痊孪性咳嗽者。3.2.2 咳嗽后伴有呕吐，严重者有结膜下出血或舌系带溃殇者。3, 2. 3新生儿或婴幼儿有原因不明的阵发性青紫或窒息者，多元典型痊咳。3.2.4 持续咳嗽两周以上，能排除其他原因者。3. 3 实验室诊断3.3. 1 臼细胞总数显著升高，淋巴细胞占50%以上。3,3.2 从病人的痰或咽喉部分泌物分离到百日咳杆菌，见附录A,3. 3. 3恢复期血清凝集抗体比急性期抗体呈四倍以上升高，见附录B,3,4 病例分类3,4, 1 疑似病例具备3.2. 1 3. 2. 2. 3. 2. 3. 3. 2. 4四项中任何一项，或同时伴有3.I项者。3,4
4、. 2 1临床诊断病例疑似病例加3.3. , 3,4, 3确诊病例疑似病例加3.3. 2或3.3. 3. 4 处理原则4, 1 对病人的隔离自发病后隔离40d，或至注李俭咳嗽出现后隔离30d。接触者观察21d. 国家技术监督局1995-12-15批准1996-07-01实施4z GB 159 9 8 199 5 4.2 对病人的治疗尽早给予抗生素治疗及对症治疗，防治并发症。4.3 发生暴发流行的应急措施4. 3. 1 对未接种百日咳茵茵的易感儿童应急接种百臼破三联混合制剂。4.3.2 与百日咳患者有密切接触史的易感儿可用药物预防。4.4 百日咳的免疫预防百日咳是种可以用茵茵预防的传染病，对易感
5、儿童实行百自破三联i昆合制齐r）接种，是预防本病的重要措施。国内外的研究表明，百日咳菌茵的预防效果是肯定的。按我国现行的免疫程序，儿童出生后第3个月开始初兔，全程免疫3针，保护率可达90%以上，第二年再加强一针。1 ii凡GB 15998-1995 附录A（标准的附录百日咳病原学诊断方法A1 病原体分离从病人鼻咽部采集标本或咳碟法分离病原体。A 1. 1 标本的采集A 1. 1. 1 咳碟法用咳碟法采集样品时，应在病人咳嗽时，将包姜（BordetGengou）二氏培养平板打开放在病人口前10 cm处，使病人对准平板表面咳嗽数次，直接收集病人咳出的飞沫。然后盖好平皿盖送检。平皿暴露时间以15s为
6、宜。A 1. 1. 2 鼻咽试子由于百日咳多发于儿童，所以采样时，病儿的头部斜依于母亲的胸怀，母亲以双手固定病儿的头部，医师以右手执棉拭子，左手按病人的头顶部，使顶端稍向下弯的棉拭子自前鼻孔进入，沿下鼻道的底部向后缓缓深入，由于鼻道虽弧形，不可用力过猛，以免发生外伤出血。待棉拭子顶端到达鼻咽腔后壁时，将棉拭子稍留片刻，以待反射性咳嗽，然后轻轻旋转一周，缓缓取出棉拭子。A 1. 2接种和菌种检定A 1. 2. 1 菌型百日咳杆菌应为革兰氏阴性呈卵圆形短小杆菌，菌体长0.5 1. 0 m。A 1. 2. 2 菌落百日咳杆菌接种于包姜二氏培养基37培养34d后其菌落呈圆形、灰白色，表面光滑，中央突起
7、，边缘整齐，具有珍珠般的光泽，菌落周围有弥散性溶血环。A 1. 2. 3 生化及抗原特性百日咳杆菌生化反应极不活跃，不发酵任何碳水化合物，不液化明胶，不产生硫化氢，不形成呵噪，不还原硝酸盐，不利用拘橡酸盐，氧化酶阴性，70%以上菌株触酶阳性。不产生尿素酶和苯丙氨酸脱氨酶。百日咳杆菌新分离菌株有英膜，毒力强，菌落光滑，称为I相菌。百日咳杆菌有6种凝集因子，1、2、3因子是主要的，籍此又可将I相菌分为三种血清型：1.2.1.3.1.2.3。血清型具相对稳定性，但可发生变异血清型不仅在自然感染，在人工传代培养过程中也可发生变异。A2 皮肤坏死试验A2. 1 每次试验最少用健康家兔或豚鼠2只，每只家兔
8、或豚鼠可同时试验数个菌株。A2. 2 将培养4048h第三代或第四代20%羊血包姜二氏培养基上的菌苔，l!l悬于缓冲盐水或生理盐水中。A2. 3将菌液用灭菌脱脂棉过滤，测定浓度。A2. 4 用生理盐水将菌液稀释成410/mL及210/mL二个浓度。A2. 5 试验前一天将健康家兔或豚鼠先行脱毛。A2. 6 注射前用75%酒精消毒，再用小试管蘸色素印在脊柱两侧、每只家兔可试验4个菌株。A2. 7 每个圈内皮内注射0.1mL，拔针时要在皮内稍稍扭转以免菌液流出。A2. 8 注射完毕要做好记录。A2. 9 注射后4872h观察坏死情况，并量坏死的大小。如两只家兔有一只注射4108个菌，注射部1(),
9、j GB 15998 1995 位出现坏死即为阳性。A3 免疫荧光法检测百日咳杆菌（直接法）A3. 1 原理将已知百日咳抗血清用化学方法结合荧光色素制成荧光抗体，以此来浸染固定在玻片上的未知细菌，若为相应细菌，则两者结合商留在玻片上，不被缓冲液所冲掉。在荧光显微镜下有荧光出现。A3. 2 材料A3. 2. 1 荧光抗体用前按说明书要求以pH7.3磷酸盐缓冲盐水进行稀释，c冰箱保存备用。A3. 2. 2 pH7. 3磷酸盐缓冲盐水氯化纳8. 5 g 磷酸氢二饷1. 07 g 磷酸二氢销。.39 g 蒸馆水1 000 ml, A3. 2. 3 荧光显微镜A3. 2. 4 其他材料0.8 1. 2
10、mm厚载玻片。0.17 mm厚的盖玻片。甘油缓冲液（90mL分析纯甘汹加10mL pH8. 2 磷酸盐缓冲液），镜泊可用液体石蜡代替。A3. 3方法A3. 3. 1 用接种环将待检标本涂布于玻片上，大小约1cm，火焰固定，用蜡笔将标本圈起。A3. 3. 2 将稀释的荧光抗体加在标本上，置湿盒，放31c温箱30mino A3. 3. 3 取出玻片，用滴管吸取35mL磷酸盐缓冲盐水将标本上荧光抗体冲洗，再依次浸入盛有磷酸盐缓冲液三个缸中浸泡，每缸35min，并不时振荡。A3. 3. 4 干燥、封载、镜检。A3. 3. 5 为使结果正确，还需作以下对照：a）标本阴性对照：标本不加荧光抗体只加磷酸盐缓
11、冲盐水b）阳性对照：荧光抗体加在已知阳性菌株标本上。c）封闭试验：将标本先加未标记的同样抗血清作用30min，充分洗涤后再加标记抗体染色，若是阳性标本，应无特异荧光。d）标本加正常未免疫的标记抗体，结果应无特异荧光。A3. 4 结果判定A3. 4. 1 荧光的强度和形态学的特征十十：菌体显著膨大，黑心清楚，荧光明亮。十十g菌体膨大，黑心清楚，荧光明亮。十十g菌体稍膨大，形态清晰，有黑心，荧光较弱。十菌体不膨大，形态不清楚，荧光微弱。z细菌无荧光。A3. 4. 2 判定标准阳性：细菌荧光在“十”以上，在片上可看到分散或成堆出现形态典型的细菌。阳性对照“十十十”，阴性对照为阴性。 ll二GB 15
12、998-1995 附录B（提示的附录）盲目咳血清学诊断方法Bl 百日咳试管凝集试验（半量法）Bl. 1 原理细菌、红血球及其他颗粒性抗原，加入含有特异性抗体的血清，在有适当的电解质存在时，经一定时间作用后，可出现肉眼可见的凝集团块，利用这种现象进行已知抗原定量测定相应抗体或已知抗体测定抗原等方法就是定量凝集试验。Bl. 2 材料B 1. 2. 1 百日咳I相标准血清效价为1: 12 800, Bl. 2. 2 百日咳菌液菌液的凝集效价应达到I相标准血清的效价的一半以上。菌液浓度定为210/mL, Bl. 2. 3 0. 85%生理盐水Bl. 2. 4 待检血清患者耳血或静脉血，分离出血清后进行
13、测定。Bl. 2. 5 凝集管及试管架Bl. 2. 6 JJt吸管（1mL、5mL、10mL) Bl. 3试验方法取待检血清0.1 mL十0.4 mL生理盐水，稀释成5倍，然后依次倍比稀释即为1I 10,1 I 20,1 I 40,l: 80,1: 160等，每管O.25 mL，并加入210/mL浓度的百日咳菌液，每管o.25 mL。充分摇匀置35c过夜，次日取出后，室温放置1h观察结果。每次试验时要设阴性对照管，即百日咳菌液加生理盐水，设阳性对照管，用一排试管，采用百日咳I和目标准血清，按己知效价进行稀释，然后每管加入百日咳菌液和试验组相同条件观察结果。Bl. 4 结果判定十s管内液体混浊，
14、少量凝集块沉于管底。十：管内液体半澄清，部分凝块沉于管底。十：管内液体不完全澄清，凝集块全部沉于管底。十十g管内液体完全澄清，凝集块全部沉于管底。若恢复期抗体滴度比急性期增高4倍以上对确诊病例很有意义。B2微量凝集试验（血凝板法）82. 1 材料B2. 1. 1 百日咳I相标准血清效价1: 12 800, B2. 1. 2 待检菌液菌液效价应达到I相标准血清效价之半，菌液浓度为31084108/ml,B2. 1. 3 稀释液0. 85%生理盐水。B2. 1. 4 U型孔血凝板111 r, 8排12孔。B2. 1. 5 可调微量移液器B2. 1-6 多孔道加样器B2. 1. 7 35 C 37
15、c：恒温箱B2. 1. 8冰箱B2. 1. 9微型振荡器B2. 1. 10 带盖搪瓷盘B2. 2 试验方法GB 15998 1995 B2. 2. 1 取标准血清o.1时，加入9.9时，生理盐水，稀释成100倍。B2. 2. 2在U型孔血凝板上，第1孔不加盐水，第2孔至第10孔分别加入0.025时，盐水第12孔也加入0.025时，盐水作为阴性对照孔。B2. 2. 3 用微量加样器向第l孔及第2孔各加0.025 mL 100倍稀释的标准血清。B2. 2. 4 用多孔道加样器从第2孔开始倍比稀释至第10孔。B2. 2. 5 将稀释好的血清每孔加入每毫升含3io 4X 108菌体的菌液0.025 ml，。B2. 2. 6 用微量振荡器振荡35min, B2. 2. 7 将血凝板放入下面垫有纱布的带盖搪瓷盘内，再放置于35C培养箱内过夜。B2. 2. 8 次日取出血凝板室温放置片刻后，将血凝板放在日光灯上面观察结果。B2. 3 结果判断B2. 3. 1 孔底呈困点状，菌体沉淀物同对照孔（。B2. 3. 2 孔底无困点状，菌体沉淀物呈微细凝集散在状（十）。B2. 3. 3 凝集明显，上清液微浑浊（十十）。B2. 3. 4 凝集明显上清液清晰（十十十）。B2.3.5 凝集呈块状，上清液清晰（十十十十）。i 07
