1、ICS 71.040.40 G 76 中华人民11: ./、和国国家标准G/T 14643.2-2009 代替GB/T14643. 2二1993工业循环冷却水中菌藻的测定方法第2部分:土壤菌群的测定平皿计数法Examination of bacteria and algae in industrial circulating cooling water 一Part 2 Examination of soil micro-bioti一Standard of plate count 2009-05-18发布中华人民共和国国家质量监督检验检夜总局中国国家标准化管理委员会2010-02-01实施发布G
2、B/T 14643.2-2009 目。自GB/T 14643(工业循环冷却水中菌藻的测定方法分为以下几个部分:第1部分:蒙古液形成菌的测定平皿计数法-一第2部分:土壤菌群的测定平皿计数法一第3部分:蒙古泥真菌的测定平皿计数法一第4部分:土壤真菌的测定平皿计数法-一第5部分:硫酸盐还原菌的测定MPN法一第6部分:铁细菌的测定MPN法本部分为GB/T14643的第2部分。本部分代替GB/T14643. 21993(工业循环冷却水中土壤菌群的测定平皿计数法。本部分与GB/T14643. 2-1993相比，在技术内容上并无变化，只是对文本结构和文字进行了修改。本部分由中国石油和化学工业协会提出。本部分
3、由全国化学标准化技术委员会水处理剂分会(SAC/TC63/SC 5)归口。本部分负责起草单位:中海油天津化工研究设计院、天津正达科技有限责任公司。本部分主要起草人z李琳、张全、白莹。本部分于1993年首次发布。I GB/T 14643.2-2009 1 范围工业循环冷却水中菌藻的测定方法第2部分:土壤菌群的测定平皿计数法GB/T 14643的本部分规定了工业循环冷却水中土壤菌群的测定方法。本部分适用于工业循环冷却水中土壤菌群的测定，也适用于原水、生活用水及其他水中土壤菌群的测定。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过GB/T14643的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随
4、后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB/T 603 化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备(GB/T603一2002，ISO6353-1: 1982 , NEQ) GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682-2008 , ISO 3696:1987 , MOD) 3 方法提要本部分采用混合培养基，利用平皿计数技术，在(29士l)OC培养72h，测定循环冷却水中土壤菌群总数。4 试剂和材料本部分所用试剂，除非另有规定，应使用分析纯试
5、剂和符合GB/T6682中三级水的规定。试验中所需制剂及制品，在没有注明其他要求时，均按GB/T603之规定制备。4. 1 牛肉膏:生物试剂。4.2 蛋白陈:生物试剂。4.3 琼脂:生物试剂。4.4 氯化锅。4.5 硝酸锅。4.6 磷酸氢二御。4. 7 氯化御。4.8 硫酸馁。4.9 硫酸亚铁。4. 10 煎糖。4. 11 土壤(果园土、菜园土)。4.12 氢氧化销溶液:40g/Lo 4. 13 乙醇溶液:75%(体积分数。1 GB/T 14643.2-2009 4. 14 硫代硫酸锅。4.15 牛皮纸。4. 16 医用脱脂棉。4. 17 医用脱脂纱布。5 仪器、设备5. 1 元菌箱(室)或超
6、净工作台。5.2 蒸汽压力灭菌器。5.3 生化培养箱。5.4 鼓风电热干燥箱:温度可控制在60oC280 oC。5.5 铝锅:rp200mm。5.6 搪瓷量杯:1000mLo5. 7 磨口三角瓶:100mL。5.8 培养皿:何omm。5.9 磨口试剂瓶:1000 mL。5.10 刻度吸管:1mLo 5. 11 刻度吸管:5mL。5. 12 三角瓶:500mL。6 试验前的准备6. 1 土壤浸出液的制备称取约100g土壤加入300g水中，采用蒸汽压力灭菌器在(121士l)OC灭菌15min，静置24h后第二次灭菌，再静置24h后进行第三次灭菌。瓶中的上层清液为土壤浸出液。6.2 培养基的制备称取
7、下列试剂:牛肉膏:1.5 g。蛋白陈:5.0go 氯化纳:2.5go 硝酸铀:2.5g。磷酸氢二饵:0.5go 氯化饵:0.2g。硫酸续:0.25go 硫酸亚铁:0.005g。庶糖:20.0g。土壤浸出液:5mL。琼脂:15.0 g。将上述试剂加水约950mL，在电炉上加热溶解后，趁热用四层医用脱脂纱布过滤于搪瓷量杯中，用热水补充至1000 mL，用氢氧化锅溶液调节pH至7.0士0.2，并分装在500mL三角瓶中，每瓶分装量不超过其总容量的2/3。塞上棉塞，用牛皮纸把瓶口包好，用蒸汽压力灭菌器于(121士1)OC灭菌15 mino 6.3 无菌稀释水的制备6.3. 1 生理盐水的配制:称取8.
8、5g氯化纳，溶解在1000 mL水中，混匀。GB/T 14643. 2-2009 6.3.2 将生理盐水分装在100mL磨口三角瓶中，每瓶45mL，每个三角瓶塞子和瓶口间插入一小纸片，塞紧瓶塞，每个瓶子的瓶口均用牛皮纸包扎以防污染，用蒸汽压力灭菌器于(121士1)OC灭菌15 mino 6.4 刻度吸管的灭菌6.4. 1 将洗净并烘干后的吸管粗端塞上医用脱脂棉，棉花量要适宜，长度大约10mm,._ 15 mm，棉花不宜露在口外，多余的棉花可以用火焰烧掉。6.4.2 每支刻度吸管用1条约40mm,._ 50 mm宽的牛皮纸条，以45。左右角度螺旋形卷起来，吸管的尖端在头部，粗端用多余的纸条折叠打
9、结，不使散开，标上量度，若干支扎成一束，置电热干燥箱中，于(160士2)OC灭菌2ho 6.5 培养皿的灭菌将洗净并烘干后的培养皿10个左右叠在一起，用牛皮纸卷成一筒，置电热干燥箱中于(160士2)OC灭菌2h。6.6 采样瓶的灭菌将洗净并烘干后的1000 mL磨口试剂瓶瓶口和瓶颈用牛皮纸裹好，扎紧，置电热干燥箱于(160士2)OC灭菌2ho 6. 7 硫代硫酸铀灭菌将硫代硫酸锅放入元菌箱(室内，并均匀地摊在离紫外线灯30cm处，灭菌30mino 7 测定步骤7. 1 水样的采集7. 1. 1 用元菌采样瓶采集被测样品，在采样过程中，要保护瓶口和瓶颈，防止这些部分受杂菌污染。瓶内要留下足够的空
10、间，以备测定之前摇晃。7. 1. 2 若采集的水中有余氯，应于采样前在元菌操作下于无菌采样瓶中加入灭过菌的硫代硫酸锅，加入量为每升水样约0.1go 7. 1. 3 水样采集后应立即进行测定，如果2h内不能进行测定，应把水样放在冰箱中，于4oC ,._ 10 oC 保存，保存时间不宜超过24h。经冷冻保存后的水样需测定时，从冰箱中取出于30oC左右活化4h，._，5 h，再进行测定。7.2 无菌箱(室)灭菌7.2.1 把实验所用的元菌稀释水、无菌培养皿、元菌吸管等用品放人元菌箱室)内，打开紫外线灯灭菌30 min 7.3 水样的稀释和接种7.3.1 关掉紫外线灯，打开荧光灯，将待测水样放入无菌箱
11、(室)中，立即用75%的乙醇溶液浸泡的医用脱脂棉球擦手，点燃元菌箱室)内的酒精灯。以下对水样的稀释和接种条的操作应在元菌箱(室内的火焰区进行。7.3.2 选择适宜的稀释度，应使最后一个稀释度接种后培养皿中生长的菌落数小于300个，在空白稀释水样瓶上标上稀释度数。7.3.3 用10倍稀释法稀释水样，即用5mL元菌吸管吸取5mL水样注入到45mL空白稀释水中充分摇匀，此时稀释度为10一107.3.4 另取一支5mL元菌吸管吸取5mL 10-1水样移入到第二个稀释水中，充分摇匀，此时稀释度为10-2，依次类推，直至需要的稀释度为止。7.3.5 将不同稀释度的水样分别接种到元菌培养皿中，每个稀释度重复
12、接种3，._，5个皿，每皿接种1 mL，接种时左手掌托住培养皿，大拇指和食指轻轻将培养皿提起，吸管与培养皿底成45。角相接。移开吸管时吸管不宜再碰到培养皿。接种时间不宜超过4s。每接种一个稀释度更换一支元菌吸管。7.3.6 另取一组培养皿不接水样，作为空白。同时操作。3 GB/T 14643.2-2009 7.3.7 将灭过菌的培养基冷却至(45士。OC，按7.3.5的方法掀开培养皿盖，将培养基灌入培养皿内，每皿应灌15mL,-,20 mLo灌皿时不要使培养基直接灌在水样上，灌皿后要将融化的培养基和皿中水样彻底混合，小心勿使混合液溅到培养皿的边缘，测定一个水样从接种到灌皿不得超过20mino
13、7.4 培养待培养皿中培养基(7.3.7)困化后，倒置平皿，在生化培养箱中(29土l)OC培养72ho 8 计数与报告8. 1 培养之后，取出培养皿，若空白培养皿出现菌落，表明测定过程中有污染，本次测定无效。8.2 选择平均菌落数在30-300之间的稀释度，立即进行计数，求得平均菌落数，并修约成二位有效数字(见表1示例1)。8.3 若有二个稀释度，其生长菌落数均在30-300之间，则视二者之比值来决定，若其比值小于2，应报告其平均数;若大于2则报告其中较小的数字(见表1示例2及示例3)。8.4 若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应选择稀释度最高的培养皿计数(见表1示例。8.5 若所有稀释
14、度的平均菌落数均小于30，则应选择稀释度最低的培养皿计数(见表1示例5)。8.6 若所有稀释度均元菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之(见表1示例6)。8. 7 若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间，其中一部分大于300而另一部分小于30时，则选择最接近30或300的培养皿计数见表1示例7)。8.8 土壤菌群的总数以p表示，单位为个每毫升(个/mL)，按式(1)计算:式中zX1 p=一F X1一一计数得出的培养皿中长出的平均菌落数，个;F一一计数组的样品稀释度数。表1稀释度及菌落数示例10-1 10-2 10-3 1 164 20 2 295 46 3 271 60 4 6 5
15、00 3 475 313 5 27 11 5 6 。7 。306 12 4 两稀释度土壤菌群总数菌落数之比个/mL16 400 1. 6 37 750 2.2 27 100 313 000 270 lX10 30 600 . ( 1 ) 报告方式个/mL1. 6X104 3.8X104 2.7X104 3.1X105 2.7X102 10 3.1X104 G/T 14643. 2-2009 9 精密度9. 1 由于微生物能以单独个体，双双成对、链状、成簇或一团团等形式存在，而且没有单独一种培养基能满足一个水样中所有细菌的生理要求。所以，由此法所得的菌落数可能要低于其正常存在的活细胞的数目。9.
16、2 标准平皿计数的正确度随着平行样皿的增加而增加，当使用5个平行皿，每皿加1mL样品时测定结果的置信度为95%。5 OON|N.的叮艺FMh阁。华人民共和国家标准工业循环冷却水中菌藻的测定方法第2部分:土壤菌群的测定平皿计数法GB/T 14643. 2-2009 国中骨中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045 网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销* 印张o.75 字数10千字2009年7月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2009年7月第一版定价16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533* 书号:155066 1-38013 GB/T 14643.2-2009 打印H期:2010年3月26日F01. 7
