1、ICS 71.040.40 G 76 中华人民11: ./、和国国家标准G/T 14643.3-2009 代替GB/T14643. 3-1993 工业循环冷却水中菌藻的测定方法第3部分:黠泥真菌的测定平皿计数法Examination of bacteria and aIgae in industrial circulating cooIing water Part 3: Examination of sIime formed fungi一Standard of plate count 2009-05-18发布中华人民共和国国家质量监督检验检茂总局中国国家标准化管理委员会2010-02-01实施
2、发布GB/T 14643.3-2009 目。吕GB/T 14643(工业循环冷却水中菌藻的测定方法分为以下几个部分:二二第1部分:蒙古液形成菌的测定平皿计数法一一第2部分:土壤菌群的测定平皿计数法二第3部分:秸泥真菌的测定平皿计数法一-第4部分:土壤真菌的测定平皿计数法一一-第5部分:硫酸盐还原菌的测定MPN法一第6部分:铁细菌的测定MPN法本部分为GB/T14643的第3部分。本部分代替GB/T14643. 3-1993(工业循环冷却水中薪泥真菌的测定平皿计数法。本部分与GB/T14643. 3-1993相比，在技术内容上并无变化，只是对文本结构和文字进行了修改。本部分由中国石油和化学工业协
3、会提出。本部分由全国化学标准化技术委员会水处理剂分会(SAC/TC63/SC 5)归口。本部分负责起草单位:中海油天津化工研究设计院、上海未来企业有限公司。本部分主要起草人:邵宏谦、刘昕、张金、李琳、朱传俊。本部分于1993年首次发布。I GB/T 14643.3-2009 1 范围工业循环冷却水中菌藻的测定方法第3部分:黠泥真菌的测定平皿计数法GB/T 14643的本部分规定了工业循环冷却水中蒙古泥真菌的测定方法。本部分适用于工业循环冷却水中蒙古泥真菌的测定，也适用于原水、生活用水及其他水中蒙古泥真菌的测定。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过GB/T14643的本部分的引用而成为本部分的
4、条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB/T 603 化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备(GB/T603-2002 , ISO 6353-1: 1982 , NEQ) GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682 2008 , ISO 3696:1987 , MOD) 3 方法提要本方法采用25号浮游生物网收集循环冷却水中的蒙古泥，所得的蒙古泥用石英砂充分研磨使细胞分散，再利用平皿计数技术在(29:
5、f:1) oc培养72h来测定蒙古泥中真菌总数。4 试剂和材料本部分所用试剂，除非另有规定，应使用分析纯试剂和符合GB/T6682三级水的规定。试验中所需制剂及制品，在没有注明其他要求时，均按GB/T603之规定制备。4. 1 马铃薯:市售新鲜(无芽)，去皮后切成约20mmX20 mmX20 mm小块。4.2 葡萄糖。4.3 琼脂:生物试剂。4.4 石英砂:210m，-，150m(70目-1 00目)。4.5 氯化锅。4.6 乳酸。4. 7 乙醇溶液:75%(体积分数。4.8 牛皮纸。4.9 医用脱脂棉。4. 10 医用脱脂纱布。5 仪器、设备5. 1 元菌箱(室)或超净工作台。5.2 蒸汽压
6、力灭菌器。1 GB/T 14643.3-2009 5.3 生化培养箱。5.4 鼓风电热干燥箱:温度可控制在60oC ,._, 280 oC。5.5 铝锅:1200mm。5.6 25号浮游生物网。5. 7 转子流量计(0，._，2m3/h)。5.8 瓷研钵。5.9 搪瓷量杯:1000 mL。5.10 磨口三角瓶:1 000 mLo 5. 11 培养皿:如ommo 5.12 容量瓶:1000 mL。5.13 刻度吸管:1mLo 5. 14 刻度吸管:5mL。5. 15 三角瓶:500mLo 5.16 量筒:500mL。5. 17 量筒:25mL。6 试验前的准备6. 1 培养基的制备称取约200g
7、的马铃薯于铝锅中，加水约1000 mL于电炉上加热，煮沸10mill并不断搅拌，趁热用四层医用脱脂纱布过滤于搪瓷量杯中，收集到约900mL滤液，滤液搅匀待用。于上述洁、液中加入20.0g琼脂和20.0g葡萄糖，并放在电炉上加热，不断地搅拌，待琼脂完全溶化后，趁热用四层医用脱脂纱布过滤，待泼、液不再滴出时，用水补充至1000 mL，并用乳酸调节pH至4.0士0.1，并分装在500mL三角瓶中，每瓶分装量不超过其总量的三分之二，塞上棉塞再用牛皮纸把瓶口包好，用蒸汽压力灭菌器于(121:I:1) oC灭菌15millo 6.2 无菌稀释水的制备6.2. 1 生理盐水的配制:称取8.5g氯化锅，溶解在
8、1000 mL 水中，混匀。6.2.2 将生理盐水分装在100mL磨口三角瓶中，每瓶45mL，每个三角瓶塞子和瓶口间插入一小纸片，塞紧瓶塞，每个瓶子的瓶口均用牛皮纸包扎以防污染，用蒸汽压力灭菌器于(121:I:l)OC灭菌15 millo 6.3 刻度吸管的灭菌6.3.1 将洗净并烘干后的吸管粗端塞上医用脱脂棉，棉花量要适宜，长度大约10mm,._, 15 mm，棉花量不宜露在口外，多余的棉花可以用火焰烧掉。6.3.2 每支刻度吸管用1条约40mm-50 mm宽的牛皮纸条，以45。左右角度螺旋形卷起来，吸管的尖端在头部，粗端将多余的纸条折叠打结，不使散开，标上量度，若干支扎成一束，置电热干燥箱
9、中于160 oC士2oC灭菌2h。6.4 培养皿的灭菌将洗净并烘干后的培养皿10个左右叠在一起，用牛皮纸卷成一筒，置电热干燥箱中于(160士2)OC灭菌2h。6.5 石英砂的灭菌将洗净并烘干后的石英砂装入磨口三角瓶中，按元菌稀释水的制备中三角瓶包扎及灭菌步骤进行包扎，灭菌。2 GB/T 14643.3-2009 7 测定步骤7. 1 样品的采集7. 1. 1 采集秸泥的装置见图101 转子流量计;2一一-浮游生物网;3一-11X-I0截止阀;4一-X43W-I0旋塞阀55一一量筒。图1采集黯泥装置图7. 1. 2 调节采样装置中的阀门，使冷却水的流速控制在0.8m/s左右，水流量在1旷/h左右
10、，然后关上浮游生物网的旋塞阀，过滤1m3水。7. 1. 3 关闭水阀，取下浮游生物网，打开旋塞阀，将蒙古泥收集在一个500mL量筒内，沉淀30min后倾出上层清液。将剩余浊液转至25mL量筒内，静置30min，记录沉淀出的蒙古泥体积。教泥量以V计，单位为毫升每立方米(mL/m勺，按式(1)计算:认一吭一一V . ( 1 ) 式中:V2一一一一量筒中蒙古泥体积的数值，单位为毫升(mL);V1 -通过浮游生物网过滤的循环水量的体积的数值，单位为立方米(m3)。7. 1. 4 用无菌吸管移去25mL量筒内的上清液，将量筒内的蒙古泥或部分蒙古泥转移至洗净并烘干后的资研钵中，加人约2g灭过菌的石英砂，充
11、分研磨后转移至1000 mL洗净并烘干后的容量瓶中，用元菌稀释水稀释至刻度，充分混匀，并立即进行测定。7.2 无菌箱(室)灭菌把试验所用的元菌稀释水、元菌培养皿、无菌吸管等用品放人元菌箱(室)内，打开紫外线灯灭菌30 min。7.3 水样的稀释和接种7.3. 1 关掉紫外线灯，打开荧光灯，将蒙古泥水样放入元菌箱(室)中，立即用75%的乙醇溶液浸泡的医用脱脂棉球擦手，点燃元菌箱(室)内的酒精灯。以下对水样的稀释和接种的操作应在元菌箱(室内的火焰区进行。7.3.2 选择适宜的稀释度，应使最后一个稀释度接种后，培养皿中生长的菌落数小于300个，在空白稀释水样瓶上标上稀释度数。7.3.3 用10倍稀释
12、法稀释水样，即用5mL元菌吸管吸取5mL水样注入到45mL空白稀释水中充分摇匀，此时稀释度为10-103 GB/T 14643.3-2009 7.3.4 另取一支5mL元菌吸管吸取5mL 10-1水样移入到第二个稀释水中，充分摇匀，此时稀释度为10一2，依次类推，直至需要的稀释度为止。7.3.5 将不同稀释度的水样分别接种到元菌培养皿中，每个稀释度重复接种3，._.5个皿，每皿接种1 mL，接种时左手掌托住培养皿，大拇指和食指轻轻将培养皿提起，吸管与培养皿底成45。角相接。移开吸管时吸管不宜再碰到培养皿，接种时间不宜超过4s。每接种一个稀释度更换一支元菌吸管。7.3.6 另取一组培养皿不接水样
13、，作为空白。同时操作。7.3.7 将灭过菌的培养基冷却至(45士1)OC，按7.3.5的方法掀开培养血盖，将培养基灌入培养皿内，每皿应灌15mL,._. 20 mL。灌皿时不要使培养基直接灌在水样上，灌皿后要将融化的培养基和皿中水样彻底混合，小心勿使混合液溅到培养皿的边缘。测定一个水样从接种到灌皿不得超过20min。7.4 培养待培养皿中培养基固化后，倒置平皿，在生化培养箱中于(29士l)OC培养72h。8 计数与报告8. 1 培养之后，取出培养皿，若空白培养皿内出现菌落，表明测定过程中有污染，本次测定元效。8.2 选择平均菌落数在30，._.300之间的稀释度，立即进行计数，求得平均菌落数，
14、并修约成二位有效数字(见表1示例。8.3 若有两个稀释度，其生长菌落数均在30，._.300之间，则视二者之比值来决定，若其比值小于2，应报告其平均数;若大于2则报告其中较小的数字(见表1示例2及示例3)。8.4 若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则选择稀释度最高的培养皿计数(见表1示例。8.5 若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应选择稀释度最低的培养皿计数(见1示表例5)。8.6 若所有稀释度均元菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之(见表1示例6)。8. 7 若所有稀释度的平均菌落数均不在30，._.300之间，其中一部分大于300而另一部分小于30时，则选择最接近30或300
15、的培养皿计数(见表1示例7)。8.8 蒙古泥真菌的数量以p表示，单位为个每毫升(个/mL)，按式(2)计算:1000X1 p = 1 000 000FV1 一nu-nu -nu v-14 咽A-X一IR-3 -v -F . ( 2 ) 式中:X1一-一按(8.2)计数得出的培养皿上生长的平均菌落数，个;V二二按(7.1.3)计算的蒙古泥量的数值，单位为毫升每立方米(mL/m3);只一一按(7.1.4)测定时所取的蒙古泥体积的数值，单位为毫升(mL);是一按(7.1.4)测定时，所取蒙古泥体积(V3)与蒙古泥总体积(V2)之比(V3二是V 2 ); F一-计数组的样品稀释度数。表1稀释度及菌落数
16、两稀释度季古泥真菌总数报告方式示例菌落数之比个/mL个/mL10-1 10-2 10-3 1 164 20 16 400 1. 6X 104 2 295 46 1. 6 37 750 3. 8X 104 3 271 60 2.2 27 100 2.7X104 4 6 500 3 475 313 313 000 3.1X105 5 27 11 5 270 2.7XI02 6 。lX10 10 7 306 12 30 600 3.1X104 4 GB/T 14643.3-2009 9 精密度9. 1 由于微生物能以单独个体、双双成对、链状、成簇或一团团等形式存在，而且没有单独一种培养基能满足一个水
17、样中所有细菌的生理要求。所以，由此法所得的菌落数可能要低于其正常存在的活细胞的数目。9.2 标准平皿计数的正确度随着平行样皿的增加而增加，当使用5个平行皿，每皿加1mL样品时测定结果的置信度为95%。5 CON-m.的寸寸FH阁。华人民共和国家标准工业循环冷却水中菌藻的测定方法第3部分:辑泥真菌的测定平皿计数法GB/T 14643.3-2009 国中骨中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销等印张o.75 字数10千字2009年7月第一次印刷开本880X 1230 1/16 2009年7月第一版定价16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533导书号:155066 1-38014 GB/T 14643.3-2009 打印日期:2010年3月26F:i F047
