1、ICS 7 1. 040. 40 G 76 中华人民11: ./、和国国家标准GB/T 14643.6-2009 代替GB/T14643.6-1993 工业循环冷却水中菌藻的测定方法第6部分:铁细菌的测定MPN法Examination of bacteria and algae in industrial circulating cooling water Part 6 : Examination of iron bacteria-MPN test 2009-05-18发布中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会2010-02-01实施发布GB/T 14643.6-200
2、9 目。吕GB/T 14643(工业循环冷却水中菌藻的测定方法分为以下几个部分:一一一第1部分:蒙古液形成菌的测定平皿计数法第2部分:土壤菌群的测定平血计数法-一第3部分:秸泥真菌的测定平皿计数法一一一第4部分:土壤真菌的测定平皿计数法一一第5部分:硫酸盐还原菌的测定MPN法一一第6部分z铁细菌的测定MPN法本部分为GB/T14643的第6部分。本部分代替GB/T14643. 6 1993(工业循环冷却水中铁细菌的测定MPN法。本部分与GB/T14643. 6一1993相比，在技术内容上并无变化，只是对文本结构和文字进行了修改。本部分的附录A、附录B、附录C为规范性附录。本部分由中国石油和化学
3、工业协会提出。本部分由全国化学标准化技术委员会水处理剂分会(SAC/TC63/SC 5)归口。本部分负责起草单位:中海油天津化工研究设计院、天津正达科技有限责任公司。本部分主要起草人:朱传俊、张全、邵宏谦。本部分于1993年首次发布。I GB/T 14643.6-2009 1 范围工业循环冷却水中菌藻的测定方法第6部分:铁细菌的测定MPN法GB/T 14643的本部分规定了工业循环冷却水中铁细菌的测定方法。本部分适用于工业循环冷却水中铁细菌的测定，也适用于原水、生活用水及粘泥中铁细菌的测定。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过GB/T14643的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引
4、用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB/T 603 化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备(GB/T603 2002 , IS0 6353-1: 1982 , NEQ) GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682二2008，IS03696:1987 ,MOD) 3 方法提要本法采用多试管发酵技术，在(29士l)OC培养14d，如果试管内棕色消失而且形成褐色或黑色沉淀，表明阳性反应，采用MPN技术，对被测试样中的铁细菌进
5、行计数。4 试剂和材料本部分所用试剂，除非另有规定，应使用分析纯试剂和符合GB/T6682中三级水的规定。试验中所需制剂及制品，在没有注明其他要求时，均按GB/T603之规定制备。4. 1 硫酸钱。4.2 硫酸镑。4.3 磷酸氢二愣。4.4 氯化钙。4.5 硝酸锅。4.6 拧橡酸铁馁。4. 7 氯化锅。4.8 氢氧化锅溶液:40g/L。4.9 盐酸溶液:1+11。4. 10 硫代硫酸锅。4. 11 乙醇溶液:75%(体积分数)0 4. 12 牛皮纸。4. 13 医用脱脂棉。5 仪器、设备5. 1 元菌箱(窒)或超净工作台。5.2 蒸汽压力灭菌器。5.3 生化培养箱。1 GB/T 14643.6
6、-2009 5.4 电热干燥箱:温度可控制在60oC -280 oC。5.5 刻度吸管:1mL。5.6 刻度吸管:5mLo 5. 7 试管:150 mmX 15 mmo 5.8 试管架。5.9 磨口三角瓶:100mLc 5. 10 磨口试剂瓶:1000 mL。5. 11 容量瓶:1000 mL。6 试验前准备6. 1 培养基的制备称取下列试弗U:硫酸续0.5 g; 硫酸钱0.5 g; 磷酸氢二饵0.5 g; 氯化钙0.2 g; 硝酸纳0.5 g; 拧棱酸铁锁10.0 g。将上述试剂溶解在1000 mL水中，用氢氧化铀溶液或盐酸溶液调节pH至6.8士0.2，并分装在试管中，每管5mL，塞上棉塞，
7、数支一捆，每捆管口用牛皮纸包扎，用蒸汽压力灭菌器于(121土l)OC灭菌15 mino 6.2 无菌稀释水的制备6.2. 1 生理盐水的配制z称取8.5g氯化纳溶解在1000 mL 水中，混匀。6.2.2 将生理盐水分装在10omL磨口三角瓶中，每瓶4钊5mL。每个三角瓶塞子和瓶口问插入一小纸片，塞紧瓶塞，每个瓶子的瓶口用牛皮纸包扎以防污染，用蒸汽压力灭菌器于(121士1)OC灭菌1巳5min 6.3 卖刻8司j度服管的灭菌6.3.1 将洗净并烘干后的刻度吸管粗端塞上医用脱脂棉，棉花量要适宜，长度大约10mm-15 mm，棉花不宜露在口外，多余的棉花可以用火焰烧掉。6.3.2 每支刻度吸管用一
8、条约40mm-50 mm宽的牛皮纸条，以450左右角度螺旋形卷起来，吸管的尖端在头部，粗端用多余的纸条折叠打结，不使散开，标上度量，若干支扎成一束，置电热干燥箱中，于(160土2)OC灭菌2h。6.4 采样瓶的灭菌将洗净并烘干后的1000 mL磨口试剂瓶瓶口和瓶颈用牛皮纸裹好，扎紧，置电热干燥箱中，于(160士2)OC灭菌2h。6.5 硫代硫酸铀灭菌将硫代硫酸纳放入无菌箱(室)内，并均匀地摊在离紫外线灯30cm处，灭菌30minc 7 测定步骤7. 1 水样的采集7. 1. 1 用无菌采样瓶采集被测样品，在采样过程中，要保护瓶口和颈部，防止这些部分受杂菌污染，瓶内要留下足够的空间，以备测定之前
9、摇匀。7. 1. 2 若采集的水中有余氯，应在采样前，在元菌操作下，于元商采样瓶中加入灭过菌的硫代硫酸钩，加入的量为每升水样约0.1gc 7. 1. 3 水样采集后应立即进行测定，如果在2h内不能进行测定，应把水样放在冰箱中于4oC - 10 oC GB/T 14643.6-2009 保存，存放时间不宜超过24h。经冷冻保存后的水样需测定时，从冰箱中取出，于30oc左右活化4h，._，5 h，再进行测定。7.2 无菌箱(室)灭菌把试验所用的元菌培养基、元菌稀释水、元菌吸管等用品放人元菌箱(室内，打开紫外线灯灭菌30 min。7.3 水样的稀释和接种7.3.1 水样放入灭过菌的元菌箱(室)中，立
10、即用75%乙醇溶液浸泡的医用脱脂棉球擦手，点燃元菌箱(室)内的酒精灯。对水样的稀释和接种的操作应在元菌箱(室)内的火焰区进行。7.3.2 选择适宜的稀释度，应使最后一个稀释度接种培养后元铁细菌生长，在空白稀释水样瓶上标上稀释度数。7.3.3 用10倍稀释法稀释水样，即用5mL元菌吸管吸取5mL水样注入到45mL空白稀释水中充分摇匀，此时稀释度为10一1。7.3.4 另取一支5mL元菌吸管吸取5mL稀释度为10一1水样注人到第二个稀释水中，充分摇匀，此时稀释度为10-2，依次类推，直至需要的稀释度为止。7.3.5 将水样(包括稀释水样)分别接种于装有培养基的试管中，试管置试管架上，每个稀释度重复
11、接种5管(根据需要也可重复接种3管或4管)，每管接种1mL，每接一个稀释度更换一支元菌吸管。7.3.6 另取一组试管培养基不接水样，作为空白。7.4 培养在生化培养箱中于(29士1)oc培养14do 8 计数与报告8. 1 凡产生褐色或黑色沉淀且原培养基中棕色消失变为透明状者，表明有铁细菌存在，以+(阳性)表示，其余试管以一(阴性)表示。8.2 如果空白出现阳性反应，表明测定过程中有污染，本次测定元效。8.3 算出10进位稀释管中阳性试管数，以阳性组合指数记录下来。8.4 在10进位稀释中多于三个稀释度时，阳性组合的指数只需要用其中依次的三个稀释度，对这三个稀释度的决定是先选出5管全部阳性反应
12、的最大稀释度，然后选出其次相连的两个更高的稀释度，算出阳性组合指数(见表1示例1、2、4)。8.5 若按照8.4所规定的原则选出三个稀释度后，有更高的稀释仍然产生一个阳性试管，就应该将这一个阳性试管并人所选择的最高稀释的阳性结果中(见表1示例3)。8.6 根据阳性组合的指数，查表A.1得出最大可能的菌数(MPN)除以阳性组合指数的第一位数字的稀释度数，即为每毫升水样中铁细菌的菌数(如果每个稀释度重复接种4管或3管，根据阳性组合的指数杏附录B表B.1或附录C表C.1)。表1稀释度、生长情况及阳性试管数阳性组合报告方式刁王例100 10-1 10-2 10-3 10-4 指数个/mL十十十十十十十
13、十+十十一一520 5.0/10-1 = 50 5 5 2 。十十十十十+十一+十一一一542 25/100 =25 2 4 2 。5 +十十十十一一十一一一十532 14/100 = 14 3 5 3 1 。+十十+十+十十十+ +一一一一510 13.5/10-2 = 3以1024 5 5 1 。5 3 GB/T 14643.6-2009 9 精密度9. 1 由于微生物是不稳定的，精确的试验不能实现，精密度的表达仅能按MPN程序。9.2 在样品中细菌的分布是不规则的，有时细菌成倍地吸附到小颗粒上，MPN正确度随着平行管的增加而增加，当使用5个平行管，每管加1mL样品时，测定结果的置信度为9
14、5%。4 GB/T 14643.6-2009 附录A(规范性附录)五个平行管最大可能的菌数五个平行管最大可能的菌数见表A.lo表A.l指数个/mL指数个/mL指数个/mL指数个/mL000 0.0 203 1. 2 400 1. 3 513 8.5 001 0.2 210 0.7 401 1. 7 520 5.0 002 0.4 211 0.9 402 2.0 521 7.0 010 0.2 212 1. 2 403 2.5 522 9.5 011 0.4 220 0.9 410 1. 7 523 12.0 012 0.6 221 1. 2 411 2.0 524 15.0 020 0.4 2
15、22 1. 4 412 2.5 525 17.5 021 0.6 230 1. 2 420 2.0 530 8.0 030 0.6 231 1. 4 421 2.5 531 11. 0 100 0.2 240 1. 4 422 3.0 532 14.0 101 0.4 300 0.8 430 2.5 533 17.0 102 0.6 301 1. 1 431 3.0 534 20.0 103 0.8 302 1. 4 432 4.0 535 25.0 110 0.4 310 1. 1 440 3.5 540 13.0 111 0.6 311 1. 4 441 4.9 541 17.0 112
16、0.8 312 1. 7 450 4.0 542 25.0 120 0.6 313 2.0 451 5.0 543 30.0 121 0.8 320 1. 4 500 2.5 544 35.0 122 1. 0 321 1. 7 501 3.0 545 45.0 130 0.8 322 2.0 502 4.0 550 25.0 131 1. 0 330 1. 7 503 6.0 551 35.0 141 1. 1 331 2.0 504 7.5 552 60.0 200 0.5 340 2.0 510 3.5 553 90.0 201 0.7 341 2.5 511 4.5 554 160.0
17、 202 0.9 350 2.5 512 6.0 555 180.0 5 GB/T 14643.6-2009 附录B(规范性附录)四个平行管时最大可能菌数四个平行管时最大可能菌数见表B.10表B.1 指数个/mL指数个/mL指数个/mL指数个/mL000 0.0 113 1. 3 231 2.0 402 5.0 001 0.2 120 0.8 240 2.0 403 7.0 002 0.5 121 1. 1 241 3.0 410 3.5 003 o. 7 122 1. 3 300 1. 1 411 5.5 010 0.2 123 1. 6 301 1. 6 412 8.0 011 0.5 1
18、30 1. 1 302 2.0 413 11. 0 012 o. 7 131 1. 4 303 2.5 414 14.0 013 0.9 132 1. 6 310 1. 6 420 6.0 020 0.5 140 1. 4 311 2.0 421 9.5 021 0.7 141 1. 7 312 3.0 422 13.0 022 0.9 200 0.6 313 3.5 423 17.0 030 o. 7 201 0.9 320 2.0 424 20.0 031 0.9 202 1. 2 321 3.0 430 11. 5 040 0.9 203 1. 6 322 3.5 431 16.5 04
19、1 1. 2 210 0.9 330 3.0 432 20.0 100 0.3 211 1. 3 331 3.5 433 30.0 101 0.5 212 1. 6 332 4.0 434 35.0 102 0.8 213 2.0 333 5.0 440 25.0 103 1. 0 220 1. 3 340 3.5 441 40.0 110 0.5 221 1. 6 341 4.5 442 70.0 111 0.8 222 2.0 400 2.5 443 140.0 112 1. 0 230 1. 7 401 3.5 444 160.0 6 GB/T 14643.6-2009 附录C(规范性附
20、录)三个平行管最大可能的菌数三个平行管最大可能的菌数见表C.L表C.1指数个/mL指数个/mL指数个/mL000 0.0 201 1. 4 302 6.5 001 0.3 202 2.0 310 4.5 010 0.3 210 1. 5 311 7.5 011 0.6 211 2.0 312 11. 5 020 0.6 212 3.0 313 16.5 100 0.4 220 2.0 320 9.5 101 0.7 221 3.0 321 15.0 102 1. 1 222 3. 5 322 20.0 110 o. 7 223 4.0 323 30.0 111 1. 1 230 3.0 330
21、 25.0 120 1. 1 231 3.5 331 45.0 121 1. 5 232 4.0 332 110.0 130 1. 6 300 2.5 333 140.0 200 0.9 301 4.0 goNl.的叮叮同阁。华人民共和国家标准工业循环冷却水中菌藻的测定方法第6部分:铁细菌的测定MPN法GB/T 14643.6-2009 国中骨中国标准出版社出版发行北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045 网址电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销争导印张O.75 字数14千字2009年7月第一次印刷开本880X12301/16 2009年7月第一版定价16.00元如有印装差错由本社发行中心调换版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533* 书号:155066 1-38017 GB/T 14643.6-2009 打印H期:2010年3月26H F017
