1、ICS 65.120 B 46 GB 中华人民共和国国家标准G/T 14700-2002 代替GB/T14700-1993 饲料中维生素B1的测定Determination of vitamin B, in feeds 2002斗0-31发布2003 - 04 -01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局GB/T 14700-2002 前言本标准修订了GB/T14700一1993(饲料中维生素Bj的测定，修订后的方法具有适用范围广、检测限低、高效、快捷、准确的特点。本标准参考了美国化学分析协会第六十七期发表的复合预混合饲料中抗坏血酸、烟眈胶、H比哆醇、硫胶素及核黄素的液相色谱分析方法和
2、美国公职分析化学家协会(1990版)(食物和维生素制品中的硫胶素荧光测定法而制定。本标准与GB/T14700一1993的主要技术差异:本标准规定了两种方法，方法1为荧光分光光度法，保留GB/T14700-1993的全部内容;在范围中补充了复合预、混合饲料;将重复性允许差相对相差改为相对偏差气方法2为高效液相色谱法，确定了试样的提取条件、色谱条件及重复性要求，并确定了该法适用于维生素Bj含量大于20mg/峙的复合预混合饲料及维生素预棍合饲料。本标准规定了荧光分光光度法为仲裁法。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出井归口。本标准起草单位:国家饲料质量监督检验中心(北京)。本标准主要起草人z李兰
3、、陈必芳、索德成。本标准所代替标准的历次版本发布情况为:GB/T14700-1993。G/ T 14700- 2002 饲料中维生素B1的测定1 范围本标准规定了用荧光分光光度仪和高效蛊且阜谱仪测定饲料中维生素Bl(硫胶素)含量的两种方法。的维生素Bl的测定。萃取3光干扰物质存在的情况，本标准规定的方d的测定。3 方法1:荧、3. 1 原理试样中维生素Bl3.2 试剂和溶液除非另有说明，旦的水。3. 2. 1 盐酸溶液c (HCl) = O. 1 mol/L。3. 2. 2 硫酸溶液c(l/ 2HzS04) =0. 05 mol / L o 3. 2. 3 乙酸铀溶液预混合饲料、维生素预混合饲
4、料中有吸附硫肢素或影响硫色素荧饲料、维生素预氓合饲料附分离提纯后，在c (CH3COONa) =2. 0 mol/L:取164g无水乙酸铀或272g结晶乙酸铀(CH3COONa 3HzO)溶于水，稀释至1000 mL。3. 2. 4 淀粉酶悬浮液100 g/L:用乙酸饷榕液(3.2.3)悬浮10g淀粉酶制剂(活性1: 250 , Takadiastase，或相当活性的其他磷酸酣酶)，稀释至100mL，使用当日制备。3. 2.5 氯化饵溶液G/T 14700 2002 250 g/Lo 3. 2. 6 酸性氧化押溶液将8.5mL浓盐酸加入至氧化梆榕掖(3.2.5)中，并稀释至1000 mLo 3
5、. 2. 7 氢氧化铀溶渣150 g/L。3. 2. 8 铁氧化饵溶液10 g/L。3. 2. 9 耐性铁翻化饵溶液4.00 mL的铁氧化饵溶液(3.2.8)与氢氧化饷溶液(3.2.7)泪合使之成100mL.此液4h内使用。3.2.10 冰Z酸溶液30 mL/L(V1V2)。3. 2. 11 人造沸石60目80目，使用前应活化，方法如下:将适量人造石置于大烧杯中，加入10倍容积的热乙酸榕液(3.2. 10).用玻璃棒均匀搅动10min.使沸石在乙酸溶液中悬浮，待沸石沉降后，弃去上层乙酸液，重复上述操作两次。换用5倍其容积的热氯化饵溶液(3.2.5)搅动清洗两次，每次15mino再用热乙酸洛液洗
6、10min。最后用热蒸锢水清洗沸石至无氯离子(用10g/L硝酸银水榕液检验)。用布氏漏斗抽洁、，100 C烘干，贮于磨口瓶中备用。使用前，检查沸石对维生素B1标准洛液的回收率，如达不到92%，须重新活化沸石。3. 2.12 维生素，标准溶液3. 2.12.1 维生素B1贮备液1:盐酸硫胶素纯品(中国药典参照标准).于五氧化二磷干燥器中干燥24 h.称取0.0500 g.搭解于pH3.54. 3的20%(V1V2)乙醇榕液中并定容至500mL.盛于棕色瓶中4CC冰箱保存，保存期3个月。该榕液含0.1mg/mL维生素B103. 2.12.2 维生素B1贮备液n:取维生素B1贮备掖1(3.2.12.
7、1)10 mL用酸性20%乙醇搭液定容至100 mL.盛于棕色瓶中4C冰箱保存，保存期1个月。该搭液含10f-lg/mL维生素B103. 2.12.3 维生素B1标准工作液:取贮备液n(3.2.12.2)2 mL与65mL盐酸溶液(3.2.1)和5时，乙酸铀溶液(3.2.3)、混合，用水定容至100mL，现用现配。该榕液含O.2g/mL维生素Bl。3. 2. 13 丽酸奎宁溶液3. 2. 13. 1 硫酸奎宁贮备液:称取硫酸奎宁0.1000 g，用硫酸(3.2.2)溶解并定容至1000 mL。贮于棕色瓶中冰箱4C保存。若溶液混浊则需重新配制。3.2.13.2 硫酸奎宁工作液:取贮备液(3.2.
8、13.1)3mL，用硫酸(3.2.2)定容至1000 mL。贮于棕色瓶中，冰箱4C保存。该溶液含0.3g/mL硫酸奎宁。3. 2. 14 正丁醇其荧光强度不超过硫酸奎宁工作液的4%，否则需用全玻璃蒸馆器重蒸锢，取114C1l8C馆份。3.2.15 无水硫酸铀3. 3 仪器、设备3. 3- 1 荧光分光光度计，备1cm石英比色杯。3. 3. 2 电热恒温水浴。3. 3. 3 电热恒温箱。3. 3. 4 实验室用样品粉碎机。3. 3. 5 分析天平:感量0.0001 g。3. 3. 6 注射器:10mL。3.3. 7 吸附分离柱:全长235mm.外径长度如下:上端贮液槽容量约为50mL , 35
9、mmX70 mm;中部吸附管8mmX130 mm;下端35mm拉成毛细管。3. 3. 8 反应瓶，具塞离心管25mL 3. 4 试样的制备GB/T 14700-2002 按GB/T14699. 1饲料采样方法采样，选取有代表性的饲料样品，至少500g，四分法缩减至100g , 磨碎，通过0.28mm孔筛，棍匀，装入密闭容器中，避光低温保存备用。3. 5 分析步骤3. 5. 1 称样称取原料、配合饲料、浓缩饲料或复合预混合饲料1g2 g(约含维生素Bj4g20g)，精确至0.001 g;维生素预混合饲料称取O.25 gO. 50 g，精确至0.0001 g，置于100mL容量瓶中。3.5.2 试
10、样溶滞的制备3. 5. 2.1 水解:将盐酸(3.2.1)65mL加入盛有试样(3.5. 1)容量瓶中，经沸水洛加热30min(或于121 C 123 C 15 kg高压釜中加热30min) ，开始加热5min10 min内不时摇动容量瓶，以防结块。3.5.2.2 酶解lU冷却容量瓶至50C以下，加5mL淀粉酶悬浮液(3.2.4)，摇匀。该试液的pH约为4.04. 5，将容量瓶于450C50C恒温箱中保温3h，取出冷却调整pH至3.5，用水稀释至100mL。3.5.2.3 过滤:将试液通过无灰滤纸过滤弃去初滤液5mL，收集滤液于锥形瓶中。预?昆料提取液需逐级稀释，使之含维生素Bl约为0.2g/
11、mL，作为试样洛液。3.5.3 试样溶液的提纯3. 5. 3. 1 制备吸附柱:取1.5g活化人造沸石(3.2.11)置于50mL小烧杯中，加入3%乙酸潜液。.2.10)浸泡。将脱脂棉置于吸附柱底部，用玻璃棒轻压。然后将乙酸浸泡的沸石全部洗入柱中(勿使吸附柱脱水)，过柱流速小于等于1mL/min为宜。再用10mL近沸的水洗柱-次。3. 5. 3. 2 吸25mL试样溶液(3.5. 2. 3)，慢慢加入制备好的吸附柱中，弃去滤液，用每份5mL近沸的水洗柱三次，弃去洗液。3.5. 3. 3 用25mL 60C70C酸性氧化饵(3.2. 6)分三次连续加入吸附柱，收集洗脱液于25mL容量瓶中，冷却后
12、用酸性氯化饵定容，7昆匀。3. 5. 3. 4 同时用25mL维生素Bj标准工作液(3.2. 12. 3)。重复3.5. 3. 1 3. 5. 3. 3操作，作为外标。3. 5.4 氧化与萃取注意:以下操作避光进行。3. 5.4.1 于两只反应管中各吸入5mL洗脱液(3.5.3.3)，记作A、B。3. 5. 4. 2 向B管加3mL氢氧化饷榕液(3.2.7)，再向A管中加3mL氧化剂碱性铁氧化拥榕液(3.2.9)，轻轻旋摇。依次立即向A管加入15mL正丁醇(3.2.14)加塞，剧烈地振摇15S，再向B管加入15 mL正丁醇加塞。共同振摇90S，静置分层。3. 5.4.3 用注射器吸去下层水相，
13、向各反应管加入约2g无水硫酸铀(3.2.1日，旋摇，待测。3.5.4.4 同时将5mL作为外标的洗脱液(3.5.3.的，置入另两只反应管，相应地记作C、D，按3.5.4.13. 5. 4. 3操作。3. 5. 5 测定3. 5. 5. 1 用硫酸奎宁工作液(3.2.13.2)调整荧光仪，使其稳定于一定数值，作为仪器工作的固定条件。3.5.5.2 于激发披长365nm，发射披长435nm处测定各反应管中萃取液(3.5.4.3)和(3.5.4.4)的荧光强度。3. 6 结果计算3. 6.1 计算公式z试样中维生素Bl含量按式(1)计算:T , - T? V? V -一一一二xc X TT X _:
14、 T3 - T4 Vj m . ( 1 ) 1)测定预混合饲料时，可省略酶解。3 GB / T 147002002 式中:l 试样中维生素BI的含量，单位为毫克每千克(mg/kg);T1一-A管试液的荧光强度;T，一-B管试破空白的荧光强度;T3-C管标准溶液的荧光强度;T4一-D管标准榕被空白的荧光强度;c-一维生素B1标准工作液榷度，单位为微克每毫升(g/mU;Vo 提取液总体积，单位为毫升(mL); V一一分取溶液过柱的体积，单位为毫升(mL);V2 酸性氯化饵洗脱液体积，单丛立n, 3- 7 重复性同一分析者对同一4. 1 原理试样中维谱系统中进行优级纯。4.2.3 冰乙酸优级纯。4.
15、2.4 三乙肢色谱纯。4.2. 5 甲醇色谱纯。4. 2.6 乙醇溶液25%CV1V2)。4. 2. 7 提取灌B/ T 6682中1级在己装入约700mL去离子水的1000 mL容量瓶中，加入50mg EDTA(4. 2.1)待全部搭解后，加入25mL冰乙酸(4.2.3)、5mL三乙胶(4.2.4)，用去离子水定容至刻度摇匀。取860mL上述洛液与140 mL甲醇(4.2.5)1昆合即得。4. 2. 8 流动相4 G8/ T 14700- 2002 在已装入约700mL去离子水的1000 mL容量瓶中，加入50mg EDTA(4. 2.1)精确至0.001g , 1. 1 .g庚皖磺酸铀(4
16、.2.2)精确至0.001g，待全部溶解后加入25mL冰乙酸(4.2.3)、5mL三乙胶(4.2.4)，用去离子水定容至刻度摇匀。用冰乙酸、三乙胶调节该梅液pH至3.40:1:0.02，过O.45m滤膜。取该溶液860mL与140mL甲醇(4.2.5)混合，超声脱气，待用。4. 2. 9 维生素81标准溶液4.2.9. 1 维生素B1标准贮备液:准确称取维生素B10.050 0 g于100mL棕色容量瓶中，加乙醇溶液(4.2.6)超声15mn，待全部溶解后，用乙醇溶液定容至刻度。此溶液浓度为500月/mL，置4C冰箱保存，保存期3个月。4.2.9. 2 维生素B，标准工作液A:准确容量瓶中，用
17、流动相(4.2.8);:54: 3. 1 4. 3. 2 pH计(带温及4. 3. 3 超声波提取菌。4. 3. 4 针头过滤器4. 3. 5 高效液相4. 4 试样的制备按GB/T1469 0. 28 mm孔筛，1昆4. 5 分析步骤注意:以下操作、4.5. 1 试样溶液的0. 001 g，置于100mL恒超声提取20min(中间旋液过0.45m(或O.2m) 4. 5.2 测定4. 5. 2. 1 高效液相色谱条件色谱柱:长150mm，内径3.9m 固定相:NoVa-pakC1R粒度4m，或流动相流速:o. 80 mL/min。温度:25C28C。进样体积:10L。检测器:紫外或二极管矩阵
18、检测器，使用波长:多种维生素联检为280nm，单检维生素也为246 nm 保留时间:约7min8 min。4. 5. 2. 2 定量测定按高效液相色谱仪说明书调整仪器操作参数。根据所测样品中维生素B1的含量向色谱柱注入标准工作被A(4.2. 9. 2)或B(4.2. 9. 3)及试样榕液(4.5.1)，得到色谱峰面积的响应值，取标准溶液峰面积5 G/T 14700 2002 的平均值定量计算。标准工作液应在分析始末分别进样，在样品多时，分析中间应插入标准工作液校正出峰时间。4.6 结果计算4.6.1 试样中维生素B1含量按式(2)计算zpi X V X Ci X V 叫=一一( 2 ) P,t
19、i X m X vi 式中:1一一试样中维生素B1的含量，单位为毫克每千克(mg/kg); m一一一试样质量，单位为克(g); Vi一一试样溶液进样体积，单位为微升(L); P i -试样榕掖峰面积值;Cj一一标准搭液浓度，单位为微克每毫升(g/mL); V，-一一标准溶液进样体积，单位为微升(L);Psti -标准榕液峰面积平均值。4.6.2 平行测定结果用算术平均值表示，保留有效数字3位。4. 7 重复性6 同一分析者对同一试样同时两次测定所得结果的相对偏差:维生素Bl含量/(mg/kg)相对偏差/(%)二三5.OOX 102 5. OOX 102 运土5.0士10.。NOON-ooh叮H阁。国华人民共和国家标准饲料中维生素矶的测定由GB/T 14700-2002 中国标准出版社出版北京复兴门外三旦河北街16号邮政编码:100045电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经售祷9峰印张3/4字数14千字2003年3月第一次印刷开本880X12301/16 2003年3月第一版印数1一1500 7c 也峰定价10.00网址书号:155066 1-19197 版权专有侵权必究举报电话:(010)6853353314700-2002
