1、ICS 65.120 B 46 GB 中华人民共和国国家标准GB/T 14701-2002 代替GB/T 14701-1993 饲料中维生素B2的测定Determination of vitamin B2 in feeds 2002 -1 0 -31发布2003 - 04 -01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检瘦总局050928077627 GB/T 14701-2002 目。吕本标准修订了GB/T14701一1993(饲料中维生素凡的测定).修订后的方法具有适用范围广、检测限低、高效、快捷、准确的特点。;卒标准参考了美国化学分析协会第六十七期发表的复合预混料中抗坏血酸、烟酌胶、日比哆
2、醇、硫胶素及核黄素的液相色谱分析方法和美国公职分析化学家协会(1990版)(食物和维生素制品中的核黄素荧光测定法而制定。本标准与GB/T14701-1993的主要技术差异:标准规定了两种方法，方法I为荧光分光光度法，保留GB/T14701-1993的全部内容，在范围中补充了复合预混合饲料，将重复性允许差相对相差改为相对偏差气方法2为高效液相色谱法，确定了试样的提取条件、色谱条件及重复性要求，并确定了该法适用于维生素B2含量大于10mg/kg的复合预棍合饲料及维生素预混合饲料。本标准规定了荧光分光光度法为仲裁法。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出并归口。本标准起草单位:国家饲料质量监督检验
3、中心(北京)。本标准主要起草人:李兰、陈必芳。本标准所代替标准的历次版本发布情况为:GB/T14701-1993 0 GB/ T 14701-2002 饲料中维生素B2的测定范围本标准规定了用荧光分光光度仪和高效液相色谱仪测定饲料中维生素Bz含量的两种方法。本标准规定的方法l适用于饲料原料、配合饲料、浓缩饲料、复合预泪合饲料、维生素预混合饲料中的维生素乱的测定。待测液中维生素侧浓度、，一中维生素Bz的测定。2 规范性引用文件下列文件中的条在修改单(不包括勘误否可使用这些文件GB/ T 6682 3 光强度与核黄n3. 2. 1 3. 2. 2 3. 2. 3 3. 2. 4 3. 2.5 连二
4、亚硫酸铀(例NazS3. 2. 6 高锚酸饵溶液，4og/几L。3. 2. 7 冰乙酸。浓度范围内其荧光强度之差与内3. 2. 8 冰乙酸榕液，c(CH3COOH)=0. 02 mol/L:将1.8 mL冰乙酸用水稀释至1000 mL。3. 2. 9 过氧化氢榕液，100mL/L，现用现配。3. 2. 10 维生素Bz标准溶液:3. 2. 10. 1 维生素B2储备液1:核黄素纯品(中国药典参照标准)于五氧化二磷干燥器中干燥24h，榕解于冰乙酸溶液(3.2.8)中，在蒸气浴上恒速搅动直至、溶解，冷却后稀释至500mL。盛入棕色瓶滴加甲苯覆盖，冰箱4C保存，保存期6个月。该榕液含0.1mg/mL
5、维生素Bz0 3. 2. 10. 2 维生素B2贮备液n:取维生素B2贮备液1(3.2.10. 1)10 mL用冰乙酸恪液(3.2.8)稀释至100 mL，盛于棕色瓶中滴加甲苯覆盖，冰箱4C保存，保存期3个月，该榕液中含10g/mL维生素Bz。G/T 14701-2002 3. 2.10.3 维生素民标准工作准:取维生素82贮备液11(3.2.10.2)10 mL，用水稀释至100mL，现用现配。该溶液中含1月/mL维生素也。3. 2. 11 荧光素标准溶液:3. 2.11.1 荧光素贮备液:称取荧光素0.050g，用水稀释至1000 mL，盛于棕色瓶中冰箱4C保存。该溶液中含50吨/mL荧光
6、素。3. 2.1 1. 2 荧光素标准工作液:取1mL荧光素贮备液(3.2. 11. 1) ，用水定容至1000 mL，盛入棕色瓶中，低温保存。该榕液每毫升中含0.05g荧光素。3. 2.12 臭甲酣绿pH指示剂取澳甲酣绿0.1g，加氢氧化饷溶液(3.2.1)2.8mL使之榕解，再加水稀释至200mLo变色范围pH3. 65. 2。3. 3 仪器、设备3. 3. 1 荧光分光光度计。3. 3. 2 分析天平:感量0.0001 g。3. 3. 3 电热恒温水浴。3. 3. 4 具塞玻璃刻度试管，15mL。3. 4 试样的制备按GB/T14699. 1采样，选取具有代表性的样品至少500g，四分法
7、缩减至100g，磨碎，通过0.28 mm孔筛，混匀，装入密闭容器中，避光低温保存备用。3. 5 分析步骤注意:全部操作避光进行。3. 5. 1 称样原料、配合饲料、浓缩饲料、复合预混合饲料称取1g2 g，精确至0.001g;维生素预泪合饲料称取O. 25 gO. 50 g，精确至0.0001 g，将试样置于100mL容量瓶中。3. 5. 2 试样溶液的制备向盛试样的容量瓶中加65mL盐酸溶液(3.2.3)，于沸水浴中加热30min(或于121C123C15 kg高压釜中加热30min) ，开始加热5min10 min时常摇动容量瓶，以防试样结块。冷却至室温后，用氢氧化饷溶液(3.2.2)调节p
8、H至6.06. 5，然后立即加稀盐酸榕液(3.2.4)使pH值约为4.5(澳甲酣绿指标剂变为草绿色)。用水稀蒋至刻度。通过中速无灰滤纸过滤、，弃去最初5mL10 mL溶液，收集滤液于100mL锥形瓶中。取整份清液，滴加稀盐酸检查蛋白质，如有沉淀生成，继续加氢氧化饷溶液，剧烈振摇，使之沉淀完全。对高含量样品，取整份的澄清液，用水稀释至一定体积使维生素B2约为O. 1g/mL。3. 5. 3 杂质氧化于a、b、c三支15mL刻度试管(3.3.4)中各吸入试样洛液(3.5.2)10mL，同时做平行，向试管a中加入1mL蒸锢水，向试管b中加入1mL维生素B2工作液(3.2.10.3)。然后各加入冰乙酸
9、(3.2.7)1 mL，旋摇?昆匀后逐个加高锚酸押溶液(3.2.6)0.5mL，旋摇混匀，静置2min，再逐个加入过氧化氢洛液(3.2.9)0.5mL旋摇，使高锚酸押颜色在10s内消褪。加盖摇动，使试管中的气体逸尽。3. 5.4 测定用荧光素(3.2.11.2)调整荧光仪，使其稳定于一定数值，作为仪器工作的固定条件。调整激发波长440 nm，测定试管a、b的荧光强度，试样榕液在仪器中受激发照射不超过10s。在试管c中加入20mg 连二亚硫酸铀(3.2.5)，摇动溶解，并使试管中的气体逸出，迅速测定其荧光强度作为空白。若榕液出现浑浊，不能读数。3. 6 结果计算3. 6. 1 计算公式:试样中维
10、生素弘含量按式(1)计算:2 T , - T , mA V =一一一x一工一T2 - T m V 式中:1一一试样中维生素B2含量，单位为毫克每千克(mg/kg); T一一试管a(试液加水)的荧光强度;T2 试管b(试液加标样)的荧光强度;T3 试管c(试液加连二亚硫酸铀)的荧光强度;m。加入维生素B2标样的量，单位为微克(g);V 试液的初始体积，单位为毫升(mL);V一测定时分取试液的体积，单位为毫升(mL);m一一试样质量，单位为克(g); n一一稀释倍数。字号值应在O川5，否则需调整样液的浓度。3. 6. 2 平行测定结果用算术平均值表示，保留有效数字3位。3. 7 重复性同一分析者对
11、同一试样同时或快速连续进行两次测定，所得结果的相对偏差:维生素B2含量/(mg/kg)5.0 5.0 二三504 方法2:高效液相色谱法4. 1 原理相对偏差/(%):1: 15 土105三士5GB/T 14701 2002 . ( 1 ) 试样中维生素B2经酸性提取液在80C100C水浴煮沸提取后，经过滤离心后的试样溶液注入高效液相色谱仪反相色谱系统中进行分离，用紫外(或二极管矩阵检测器)检测，外标法计算维生素B2的含量。4.2 试剂和溶液除特殊说明外，所用试剂均为分析纯，水为蒸馆水，色谱用水为去离子水，符合GB/T6682中1级用水规定。4.2.1 乙二肢四乙酸二铀(EDTA)。4.2.2
12、 庚皖磺酸铀(PICB7)，优级纯。4.2.3 冰乙酸，优级纯。4.2.4 三乙肢，色谱纯。4.2.5 甲醇，色谱纯。4.2.6 提取液:在巳装入约700mL去离子水的1000 mL容量瓶中，加入50mg EDTA(4. 2.1)待全部溶解后，加入25mL冰乙酸(4.2.3)、5mL三乙胶(4.2.4)，用去离子水定容至刻度摇匀。4.2.7 流动相:在已装入约700mL去离子水的1000 mL容量瓶中，称入50mg(精确至0.001g)ED TA(4._2.1)、1.1 g (精确至O.OOlg)庚皖磺酸铀(4.2.2)，待全部溶解后加入25mL冰乙酸(4.2.3)、5 mL三乙胶(4.2.的
13、，用去离子水定容至刻度摇匀。用冰乙酸、三乙肢调节该榕液pH至3.40士0.02，过0.45m滤膜。取该溶液860mL与140mL甲醇(4.2.5)混合，超声脱气，待用。4.2.8 维生素B2标准溶液4.2.8.1 维生素也标准贮备液:准确称取维生素B20.0100g于200mL棕色容量瓶中，加1mL冰乙3 GB/T 14701 - 2002 酸(4.3)在沸水浴80C100C煮沸30min，待冷至室温后，用去离子水定容至刻度。此榕液浓度为50g/mL，冰箱4C避光保存，保存期6个月。4.2.8.2 维生素B2标准工作液:准确吸取5.0mL维生素B2标准贮备液(4.2.8. 1)于50mL棕色容
14、量瓶中，用流动相(4.2.7)定容至刻度。该标准工作液浓度为5问/mL，待上机。4. 3 仪器、设备4.3.1 实验室常用玻璃器皿。4. 3. 2 pH计(带温控，精确至0.01)。4. 3. 3 恒温水浴，OOC100C。4. 3. 4 针头过滤器，备0.45m(或O.2m)滤膜。4. 3. 5 高效液相色谱仪，带紫外或二柑醺嘿4.4 试样的制备0.28 mm孔筛，r昆匀，装4.5 分析步骤注意:全部操作4.5.1 试样溶液的称取维生素0.001 g，于10030 min，待冷却由提取液进一4.5.2 测定固定相:N流动相流温度:25-C进样体积:1 检测器:紫外267 nm 保留时间:约1
15、04.5.2.2 定量测定按高效液相色谱仪说样溶液(4.5.1)，得到色谱峰标准工作液应在分析始末4.6 结果计算4.6.1 试样中维生素岛的含量按式(2)计算:4 P; X V X C; X V )， 一一一-PSt; X m X V; 式中:l一一试样中维生素岛的含量，单位为毫克每千克(mg/kg); m一一试样质量，单位为克(g); V; -试样溶液进样体积，单位为微升(L);P;试样榕液峰面积值;缩减至100g，磨碎，全部通过1 g5 g，精确至100C水浴中煮沸预混合饲料样液需 ( 2 ) Cj一一标准榕液浓度，单位为微克每毫升(g/mL); Vst 标准榕液进样体积，单位为微升(L
16、); Pj -标准溶液峰面积平均值。4.6.2 平行测定结果用算术平均值表示，保留有效数字3位。4. 7 重复性同一分析者对同一试样同时两次平均测定结果的相对偏差:维生素B2含量/(mg/kg) 1. OOX 103 101. OOX 103 相对偏差/(%)士5.。:l:10.0 GB/T 14701-2002 F J NOON-EK叮H阁。国华人民共国家标准饲料中维生素矶的测定GB/T 14701-2002 和白9峰中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码:100045 电话:6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经售9峰印张3/4字数12千字2003年3月第一次印刷开本880X1230 1/16 2003年3月第一版印数1-1500 JL 9导定价10.00网址书号:155066. 1-19185 版权专有侵权必究举报电话:(010)68533533GB/T 14701一2002
